Antivirale Wirkung von Cetylpyridiniumchlorid in Mundwasser bei SARS

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14050 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Cetylpyridiniumchlorid (CPC), eine quartäre Ammoniumverbindung, die in Mundwasser enthalten ist, wirkt gegen Bakterien, Pilze und behüllte Viren. Diese Studie wurde durchgeführt, um die antivirale Wirkung von CPC auf SARS-CoV-2 zu untersuchen. Es gibt nur wenige Berichte über die Wirkung von CPC gegen Wildtyp-SARS-CoV-2 bei niedrigen Konzentrationen wie 0,001 %–0,005 % (10–50 µg/ml). Interessanterweise stellten wir fest, dass niedrige Konzentrationen von CPC die Infektiosität isolierter menschlicher SARS-CoV-2-Stämme (Wuhan, Alpha, Beta und Gamma) sogar im Speichel unterdrückten. Darüber hinaus haben wir mittels Saccharosedichteanalyse und elektronenmikroskopischer Untersuchung gezeigt, dass CPC Anti-SARS-CoV-2-Wirkungen zeigt, ohne die Virushülle zu zerstören. Zusammenfassend lieferte diese Studie experimentelle Beweise dafür, dass CPC die SARS-CoV-2-Infektion auch bei niedrigeren Konzentrationen hemmen kann.

Nach aktuellen Informationen des Coronavirus Resource Center der Johns Hopkins University of Medicine1 ist COVID-19 weltweit für mehr als 420 Millionen Fälle und rund 6 Millionen Todesfälle verantwortlich.

SARS-CoV-2 wurde ursprünglich in Wuhan, China, gemeldet2 und es wurden auch einige interessante und besorgniserregende Varianten (VOCs) gemeldet3. Darüber hinaus besteht die Sorge, dass einige Varianten wie Delta und Omicron in der Lage sein könnten, der impfinduzierten Immunität zu entgehen4,5,6. Daher befürchten Wissenschaftler, dass die SARS-CoV-2-Pandemie auch nach der Erhöhung der Impfrate anhalten könnte.

Es wurde berichtet, dass SARS-CoV-2 Epithelzellen der Mundschleimhaut und der Speicheldrüsen infiziert, die virale Eintrittsfaktoren, das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) und die Mitglieder der Transmembranprotease Serin (TMPRSS) exprimieren7. Somit spielt die Mundhöhle eine entscheidende Rolle bei der Infektion und Übertragung von SARS-CoV-2. Obwohl das Symptom von COVID-19 im Zusammenhang mit der Mundhöhle Dysgeusie und Stomatitis ist8,9, könnten viele mit SARS-CoV-2 infizierte Menschen asymptomatisch sein, was zu einer Übertragung auf andere Menschen führen könnte.

SARS-CoV-2 kann sich in der Mundhöhle vermehren und in den Speichel gelangen7. Darüber hinaus kann sich SARS-CoV-2 im Atemwegsepithel vermehren10 und durch Husten in die Mundhöhle übertragen werden. Die Übertragung von SARS-CoV-2 durch Tröpfchen und/oder Aerosole führt zu einer Infektion und Replikation in Lungenalveolarepithelzellen, was zu Alveolarschäden führt11. Darüber hinaus wird berichtet, dass die Übertragung von SARS-CoV-2 durch Tröpfchen bei Ausatmungsaktivitäten wie Sprechen, Husten und Niesen erfolgt12,13. Interessanterweise können SARS-CoV-2-infizierte Personen auch während der asymptomatischen Inkubationszeit des Virus zu einer Übertragungsquelle werden14. Daher müssen wir die Prophylaxestrategie gegen COVID-19 untersuchen. Darüber hinaus wurde über den Zusammenhang zwischen der Aspiration von Tröpfchen aus Speichel, der SARS-CoV-2 enthält, und der Verschlimmerung von COVID-19 berichtet15. Daher ist Mundpflege wichtig, um die Übertragung von SARS-CoV-2 zu verhindern.

Mundwasser konzentriert sich auf die Vorbeugung von Mikrobiominfektionen16. Darüber hinaus wurde kürzlich berichtet, dass mehrere Bestandteile von Mundwasser SARS-CoV-2-Virionen in der Mundhöhle reduzieren17,18. Cetylpyridiniumchlorid (CPC) wird häufig als einer der bakteriziden Bestandteile von Mundwässern, Tabletten, Sprays und Tropfen verwendet. CPC kann die Lipidmembran durch physikalisch-chemische Wechselwirkungen zerstören. Es wurde bereits berichtet, dass CPC bakterizide Wirkungen sowie antivirale Wirkungen gegen Influenzaviren19 und Coronaviren20,21,22 hat. Im Vergleich zu anderen Inhaltsstoffen in Mundwässern, einschließlich Povidon-Jod und Chlorhexidin (CHX); CPC ist geschmacks- und geruchsneutral und daher für Anwendungen in Mundpflegeprodukten geeignet. Bisher gibt es nur wenige Berichte, die eine viruzide Wirkung von CPC gegen SARS-CoV-2 belegen. Seneviratne et al. berichteten, dass CPC die Viruslast von SARS-CoV-2 im Speichel von vier Patienten mit COVID-1923 im Vergleich zum Kontrollwasser reduzierte, die virale Infektiosität im Speichel wurde jedoch nicht beschrieben. Ein aktueller Bericht zeigte die Wirkung von CPC in viel geringerer Konzentration als die von CPC in kommerziell erhältlichen Mundwässern gegen Pseudoviren24. Es gibt jedoch keinen Bericht über die Wirkung von CPC in niedrigen Konzentrationen wie 0,001 %–0,005 % (10–50 µg/ml) gegen Wildtyp-SARS-CoV-2 im Speichel. In Japan beträgt die CPC-Konzentration in kommerziell erhältlichen Mundwässern fast 30–50 µg/ml, was viel niedriger ist als in den Mundwässern, die in den vorherigen Berichten verwendet wurden24,25. Daher haben wir die antivirale Wirkung von CPC auf SARS-CoV-2 in niedrigen Konzentrationen untersucht. Darüber hinaus untersuchten wir auch den Mechanismus der Anti-SARS-CoV-2-Aktivität von CPC durch Saccharosedichteanalyse und elektronenmikroskopische Beobachtung.

Wir haben die SARS-CoV-2-Stämme untersucht, darunter Wuhan, Alpha, Beta und Gamma, die zu VOC gehören. Der Plaque-Assay zeigte, dass CPC die Infektiosität aller untersuchten SARS-CoV-2 direkt und dosisabhängig signifikant unterdrückte (Abb. 1a–d, S1). Die Behandlung mit CPC (50 μg/ml) inaktivierte den SARS-CoV-2 Wuhan-Stamm vollständig, ähnlich wie Triton X-100 (1 %) (Abb. 1e). Ein handelsübliches Mundwasser (SP-T medizinisches Gurgelmittel: SP-T), das die gleiche CPC-Konzentration enthielt, zeigte eine bessere antivirale Wirkung als eine CPC-Lösung ohne störende Inhaltsstoffe. Der Virustiter von SARS-CoV-2, behandelt mit SP-T, lag unter der Nachweisgrenze von 2,0 × 103 PFU/ml (Abb. S2). Diese Ergebnisse zeigten, dass die niedrigeren Konzentrationen von CPC (10–40 μg/ml) als die von kommerziell erhältlichem Mundwasser (50 μg/ml) bei vielen Stämmen, einschließlich VOC, eine Anti-SARS-CoV-2-Wirkung zeigten.

Antivirale Wirksamkeit von CPC gegen SARS-CoV-2 durch Plaque-Assay unter Verwendung von Vero E6-Zellen, die das TMPRSS2-Gen exprimieren (VeroE6/TMPRSS2). Die Virustiter wurden gezählt und der Virustiter der SARS-CoV-2-Stämme Wuhan (a), Alpha (b), Beta (c) und Gamma (d) bei Raumtemperatur mit CPC (0–40 μg/ml) behandelt 30 Minuten wurden quantifiziert und als PFU/ml dargestellt. Der Plaque-Assay wurde auch in Gegenwart von PBS, CPC (50 μg/ml) oder Triton X-100 (1 %) für 10 Minuten durchgeführt. Danach wurden die Proben durch PD-10-Säulen filtriert, um Reagenzien (e) zu entfernen. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse durchgeführt. (*p < 0,05).

Als nächstes bewerteten wir die Wirkung von CPC auf den Zelleintritt von SARS-CoV-2. Die VeroE6/TMPRSS2-Zellen wurden mit dem CPC-behandelten SARS-CoV-2 Wuhan-Stamm bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 infiziert. Das Ausmaß der viralen RNA-Expression in den Zellen wurde durch CPC dosisabhängig 24 Stunden nach der Infektion signifikant reduziert (Abb. 2). Die Kopienzahl der viralen RNA wurde durch CPC bei einer Konzentration von 15 μg/ml im Vergleich zur Kontrolle auf etwa ein Dreißigstel reduziert. Diese Daten zeigten, dass die Menge an infektiösen Virionen durch CPC vor dem Zelleintritt verringert wurde. Alle Experimente wurden mit CPC in einer Konzentration durchgeführt, die keine Zytotoxizität verursachte (Abb. S3).

Antivirale Wirksamkeit von CPC gegen SARS-CoV-2 durch qRT-PCR. VeroE6/TMPRSS2-Zellen wurden mit dem SARS-CoV-2-Stamm Wuhan bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 nach dem Mischen der gleichen Menge CPC inokuliert. 24 Stunden nach der Infektion wurden die relativen Mengen an viraler N-Protein-RNA quantitativ mittels qRT-PCR bewertet. (*p < 0,05).

Um herauszufinden, ob CPC bei SARS-CoV-2 in Speichel, der viele Proteine enthält und hochviskos ist, wirksam ist, haben wir die Infektiosität des Wuhan-Stamms SARS-CoV-2 mittels Plaque-Assay nach Inkubation mit CPC in Speichel von gesunden Freiwilligen gemessen. Der Plaque-Assay zeigte die hemmende Wirkung von CPC (25–40 μg/ml) gegen SARS-CoV-2 im Speichel signifikant und dosisabhängig (Abb. 3).

Antivirale Wirksamkeit von CPC gegen SARS-CoV-2 mit Speichel durch Plaque-Assay unter Verwendung von Vero E6-Zellen, die das TMPRSS2-Gen exprimieren (VeroE6/TMPRSS2). Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde in den Speichel gegeben und mit der gleichen Menge CPC gemischt. (*p < 0,05).

Um den Mechanismus von CPC auf die SARS-CoV-2-Infektiosität zu analysieren, führten wir eine Saccharosedichteanalyse von SARS-CoV-2-Virionen durch, die entweder mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), CPC (50 μg/ml) oder Triton X- behandelt wurden. 100 (1 %) für 10 Minuten bei Raumtemperatur (Abb. 4a). Das S- und N-Protein von SARS-CoV-2 zeigte eine spezifische Verteilung über den gesamten Gradienten. Die Bandenverschiebung wurde bei den mit Triton X-100 behandelten Virionen beobachtet; Die Fraktionen unterschieden sich jedoch von denen, die mit PBS oder CPC behandelt wurden. Mit anderen Worten: PBS und CPC haben möglicherweise keinen Einfluss auf die Struktur der SARS-CoV-2-Virionen, wohingegen Triton X-100 die Struktur veränderte. Darüber hinaus wurde die Morphologie der Virionen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass die sphärische Partikelstruktur des mit PBS behandelten SARS-CoV-2 unverändert blieb. Wir fanden auch heraus, dass die meisten Viruspartikel, die mit 10 µg/ml CPC behandelt wurden, unverändert blieben, während einige mit 50 µg/ml CPC zerfielen. Im Gegensatz dazu wurden fast alle mit 250 µg/ml CPC behandelten Viruspartikel deutlich zerstört (wie 1 % Triton X-100). Die Menge von 50 µg/ml galt als Konzentration, bei der nicht alle Viruspartikel zersplitterten. Dieses Ergebnis stimmt mit den Daten der Saccharosedichteanalyse überein (Abb. 4b).

Saccharosedichteanalyse und TEM-Analyse von SARS-CoV-2-Partikeln. (a) Saccharosedichteanalyse der Kapsidanordnung in Gegenwart von 1 × PBS, CPC (50 μg/ml) und Triton X-100 (1 %). Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde 10 Minuten lang mit den beschriebenen Regenten behandelt, und die behandelten Virionen wurden der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzogen. Jede Fraktion wurde einer SDS-PAGE unterzogen und durch Western Blot mit Antikörpern gegen S-Protein und N-Protein analysiert. (b) Elektronenmikroskopische Aufnahmen von SARS-CoV-2-Virionen nach Behandlung mit Reagenzien. Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 × PBS, CPC (10, 50, 250 μg/ml) und Triton X-100 (1 %) behandelt. Jeder Maßstabsbalken repräsentiert 50 nm.

In dieser Untersuchung haben wir gezeigt, dass CPC in einer niedrigen Konzentration von 50 μg/ml oder weniger die Infektiosität des Wuhan-Stamms SARS-CoV-2 und VOCs, einschließlich Alpha-, Beta- und Gamma-Stämme, unterdrückt. CPC zeigte sogar im Speichel viruzide Wirkung gegen SARS-CoV-2. Somit stellten wir fest, dass niedrige CPC-Konzentrationen eine ausreichende antivirale Aktivität gegen SARS-CoV-2 ausübten. Da CPC die Lipiddoppelschichten zerstört, können hohe CPC-Konzentrationen zytotoxische Wirkungen haben. Daher kann CPC in einer Formulierung angewendet werden, die bei niedrigen Konzentrationen ihre Wirkung über einen langen Zeitraum entfalten kann. Da die Prototyp-Mundwasserformulierung möglicherweise andere störende Inhaltsstoffe enthält, um die in den Experimenten verwendeten niedrigen CPC-Werte zu unterdrücken, haben wir ein kommerzielles Mundwasser mit der gleichen CPC-Konzentration getestet, das die gleiche oder eine bessere antivirale Wirkung zeigte als die CPC-Lösung ohne störende Inhaltsstoffe ( Abb. S2). Darüber hinaus könnten wir vermuten, dass die antivirale Wirkung möglicherweise nicht auf die Zerstörung der Lipidmembran, sondern auf die Denaturierung des SARS-CoV-2-Proteins zurückzuführen ist.

Es wurde berichtet, dass CPC gegen die SARS-CoV-2-Alpha-Variante wirksam ist24. Unsere Studie ergab, dass CPC in niedrigen Konzentrationen die Infektiosität von zwei weiteren Varianten (Beta- und Gamma-Stämme) abschwächt. Eine einstündige CPC-Behandlung zeigte keine Zytotoxizität gegenüber VeroE6/TMPRSS2 bis zu 40 μg/ml (Abb. S3). Darüber hinaus wurde in früheren Studien Mundwasser mit einer höheren CPC-Konzentration verwendet (500–750 μg/ml)24,25. Es wird davon ausgegangen, dass bei diesen Konzentrationen die Lipidmembran der Zellen geschädigt werden könnte.

Die Dauer der antiviralen Wirkung von CPC-haltigem Mundwasser ist noch nicht klar; Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass eine niedrigere Konzentration ausreicht, um eine antivirale Wirkung zu zeigen. Als Einschränkung dieses Experiments wird bei der Anwendung von CPC als Mundwasser davon ausgegangen, dass die Wirkdauer innerhalb einer Minute liegt. Angesichts der Komplexität der experimentellen Technik und der Möglichkeit von Fehlern bei der Wirkungsdauer zwischen den Proben wurde die Mindestwirkungsdauer in unserer Studie jedoch auf 10 Minuten festgelegt. In diesem Zusammenhang haben Anderson et al. haben die Wirkung von CPC bei einer Einwirkungszeit von 30 s mithilfe einer Methode zur Neutralisierung von CPC26 aufgeklärt. Daher ist es gerechtfertigt, neue Produkte wie Tabletten, Tropfen und Pflaster zu entwickeln, die CPC in einer sicheren Konzentration freisetzen und so lange wie möglich in der Mundhöhle verbleiben können.

Wir haben gezeigt, dass CPC die SARS-CoV-2-Infektiosität in viskosem Speichel, der verschiedene Proteine enthält, unterdrückt. Es scheint jedoch, dass die Wirkung im Speichel im Vergleich zu PBS abgeschwächt ist. Dies kann auf das Vorhandensein negativ geladener Speichelproteine, eine verringerte Diffusionseffizienz aufgrund der Viskosität und die Bildung von Mizellen zurückzuführen sein27. Allerdings zeigten bereits geringe CPC-Konzentrationen eine ausreichende Unterdrückung der SARS-CoV-2-Infektiosität. Die unterdrückenden Auswirkungen niedriger CPC-Konzentrationen auf die Infektiosität von SARS-CoV-2 im Speichel tatsächlicher COVID-19-Patienten müssen noch geklärt werden.

Es wurde angenommen, dass der Wirkmechanismus, der die Infektiosität von SARS-CoV-2 unterdrückt, auf der Zerstörung der Virushülle beruht. Diese Studie zeigte, dass CPC SARS-CoV-2 inaktiviert, ohne die Viruspartikel bei der Konzentration und Dauer der Experimente zu zerstören. Es wurde berichtet, dass hohe Konzentrationen (250–500 μg/ml) von CPC die Hülle von SARS-CoV-222,28 zerstören. Daher variiert der von der CPC-Konzentration abhängige Grad des morphologischen Abbaus. Mit anderen Worten: Die Partikel werden zerknittert, aber nicht zersplittert, und zwar in einer Konzentration, die noch ausreicht, um das Virus zu deaktivieren. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen der Saccharose-Dichtegradientenanalyse überein. Darüber hinaus stützt der in unserer Studie gezeigte antivirale Mechanismus von CPC aus den oben genannten Gründen die Feststellung, dass CPC hauptsächlich die Lipidmembran beeinträchtigt29. Abbildung 4b zeigt Viruspartikel unterschiedlicher Größe. In früheren Berichten schwankte der Durchmesser von SARS-CoV-2 zwischen etwa 60 und 140 nm, was mit den vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt2,5,30. Der detaillierte Mechanismus der Inaktivierung von SARS-CoV-2 durch eine geringere CPC-Konzentration ist jedoch noch unklar. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der denaturierende Effekt des S-Proteins am Eintritt beteiligt sein könnte und eine entscheidende Rolle zu spielen scheint.

Es wird angenommen, dass Viren über die Mund- und Nasenhöhle in den Organismus gelangen31. Durch die Anwendung von CPC-haltigen Nasensprays und die Reduzierung der Virusmenge in der Nasenhöhle kann eine Kontrolle der COVID-19-Infektion erreicht werden. Bisher gibt es jedoch keinen Bericht über die Verwendung von CPC-Nasensprays und deren präventive Wirkung ist noch unbekannt.

Derzeit führen wir eine klinische Studie durch, um die Wirkung von CPC bei COVID-19-Patienten zu untersuchen. Dabei geht es um die Wirkung von CPC auf die SARS-CoV-2-Viruslast im Speichel von Patienten. Eine niedrige Viruslast im Speichel kann zu einer geringen Übertragungsrate und einem geringeren Krankheitsverlauf führen.

Die Verwendung von CPC-haltigen Produkten kann zu einer Verringerung der Zahl neu infizierter Covid-Patienten führen. Darüber hinaus kann es in schlecht geimpften Ländern ein Mittel zur Vorbeugung sein. Wir gehen davon aus, dass CPC als eines der Instrumente zur Verhinderung des Ausbruchs und der Infektion von SARS-CoV-2 eingesetzt wird.

Vero E6-Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (v/v), gehalten und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Für diese Studie wurden auch Vero E6-Zellen verwendet, die stabil humane TMPRSS2-Zellen (VeroE6/TMPRSS2) exprimieren.

Die Stämme SARS-CoV-2 Wuhan (WK-521; EPI_ISL_408667), Alpha (QK002; EPI_ISL_768526), Beta (TY8-612; EPI_ISL_1123289) und Gamma (TY7-501; EPI_ISL_833366) wurden freundlicherweise von Dr. Saijo (National) zur Verfügung gestellt Institut für Infektionskrankheiten, Tokio, Japan). Diese Viren wurden unter Verwendung von VeroE6/TMPRSS2-Zellen hergestellt. Alle Experimente mit SARS-CoV-2 wurden in der Biosafety Level-3 (BSL-3)-Einrichtung des International Institute for Zoonosis Control (genehmigte Nummer: 19(19), #21002-3) der Universität Hokkaido durchgeführt und folgten dem Standard Betriebsabläufe von BSL-3. Darüber hinaus wurden alle experimentellen Designs mit Krankheitserregern von der Graduiertenschule für Zahnmedizin der Universität Hokkaido genehmigt (genehmigte Nummer: R-2-4-1).

CPC (TCI, Tokio, Japan) wurde mit entionisiertem destilliertem Wasser (DDW) gelöst und durch einen Filter (0,45 µm Durchmesser) (Sartorius, Göttingen, Deutschland) sterilisiert. Darüber hinaus wurde Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ein Tensid, als Positivkontrolle verwendet. Als Negativkontrolle wurde PBS verwendet.

Speichel wurde von fünf gesunden, ungeimpften Freiwilligen bereitgestellt. Alle Speichelproben wurden vor den Experimenten durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) als SARS-CoV-2-negativ bestimmt und in einem Röhrchen gemischt. Dieses Experiment wurde von der Institutionellen Ethikkommission der Universität Hokkaido genehmigt, um von Menschen stammende Materialien zu verwenden. Vor der Speichelentnahme wurde von jedem Freiwilligen eine Einverständniserklärung eingeholt (genehmigte Nummer: 2021-2).

Die Zelllebensfähigkeit von VeroE6/TMPRSS2 wurde durch einen MTS-Assay [3-(4,5-Dimethylthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] unter Verwendung von CellTiter 96 gemessen AQueous One Solution (Promega, Madison, WI, USA) in Gegenwart verschiedener CPC-Konzentrationen (0–50 µg/ml) für 1 Stunde bei 37 °C. Die Absorption wurde mit GloMax Multiplus Plate Reader/Luminometer (Promega) gemessen. Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt.

SARS-CoV-2-Stämme wurden mit einer gleichen Menge CPC-Lösung (Endkonzentration: 0–50 µg/ml mit DMEM mit 2 % FBS) oder medizinischem Gurgelmittel SP-T (Lion Corporation, Tokio, Japan) gemischt, das verdünnt wurde in PBS auf eine Konzentration von 50 µg/ml, ähnlich wie bei CPC. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit 2 % FBS DMEM auf 1/10 verdünnt, um CPC in der Mischung zu reduzieren. Die verdünnte Mischung wurde in VeroE6/TMPRSS2-Zellen inokuliert und 1 Stunde lang bei 37 °C unter Rotation inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit 1 × PBS gewaschen, um CPC zu entfernen, und dann mit 2 % FBS DMEM mit 1,2 % Bacto-Agar (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) überschichtet. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen über Nacht mit 3,7 % gepuffertem Formaldehyd fixiert. Fixierte Zellen wurden mit 1 % Kristallviolett gefärbt. Mit SARS-CoV-2 infizierte Zellen zeigten zytopathische Wirkungen und die infizierten Zellhaufen können als ungefärbte Bereiche wie Plaques gesehen werden.

VeroE6/TMPRSS2-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 1,0 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät. Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde mit der gleichen Menge CPC gemischt (Endkonzentration: 0–25 μg/ml). Bei jeder Arzneimittelkonzentration wurden die Vertiefungen mit 1,0 × 103 PFU (MOI = 0,01) Virus infiziert. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gemische in VeroE6/TMPRSS2-Zellen inokuliert und 1 Stunde lang bei 37 °C unter Rotation inkubiert. Nach einer Stunde Absorption wurden die Zellen zweimal mit 1 × PBS gewaschen, um CPC zu entfernen, und in Erhaltungsmedium kultiviert. 24 Stunden nach der Infektion (hpi) wurden Gesamt-RNAs aus inokulierten Zellen mit TRIzol™-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und Gesamt-RNA mit RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) extrahiert. Die extrahierten RNAs wurden einer qRT-PCR-Analyse mit dem THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit (TOYOBO, Osaka, Japan) unterzogen. Das SARS-CoV-2-Genom wurde mithilfe von Primersondensätzen für N2 (Takara, Shiga, Japan) quantifiziert. Als endogene Kontrolle wurde nichtmenschliches Primaten-β-Aktin eingesetzt. Die Primer- und Sondensequenzen für β-Actin nichtmenschlicher Primaten wurden zuvor beschrieben33. Die Spiegel des N-Gens von SARS-CoV-2 wurden mit denen der β-Actin-mRNA34 normalisiert. Darüber hinaus wurden die viralen RNA-Spiegel bei 24 hpi mit viralen RNA-Spiegeln bei 0 hpi normalisiert. Alle RT-PCR-Tests wurden mit dem CFX96 Real-Time PCR System (BioRad, Hercules, CA, USA) durchgeführt. Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde dem Speichel gesunder Freiwilliger zugesetzt und mit der gleichen Menge CPC gemischt (Endkonzentration: 0–40 μg/ml). Die Speichelmischungen wurden auf 1/100 verdünnt, um die Viskosität zu verringern, und durch 0,45-μm-Filter (Sartorius) filtriert, um Bakterien und Pilze zu entfernen. Der Plaque-Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Abschnitt „Plaque-Assay“). Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit CPC (50 μg/ml) oder Triton X-100 (1 %) behandelt. Nach der Inkubation wurden die Gemische auf Saccharose-Dichtegradienten von 10–50 % aufgetragen. Nach 6-stündiger Ultrazentrifugation mit Optima °C für 5 Min. Nach dem Kochen wurden sie durch 10 % SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-SARS-CoV-2-S-Protein-Antikörpers (GTX632604) oder eines polyklonalen Kaninchen-N-Protein-Antikörpers (GTX135357) (GeneTex, Irvine, CA, USA). Die Membranen wurden nach dem Transfer bei 100 kDa geschnitten und mit S-Protein-Antikörper bzw. N-Protein-Antikörper hybridisiert und einer Visualisierung unterzogen. Für die Bildgebung wurde ein ImageQuant LAS 4000 mini (FUJIFILM Corporation, Tokio, Japan) verwendet (Abb. S4).

Der SARS-CoV-2-Stamm Wuhan wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 × PBS, CPC (10, 50 und 250 μg/ml) und Triton X-100 (1 %) behandelt. Die Mischungen wurden mit 2,5 % Glutaraldehyd 24 Stunden lang bei 4 °C fixiert. Die fixierte Probe (5 μl) wurde auf ein Blatt Parafilm gegeben. Auf jeden Tropfen wurde Formvar-Film (Nr. 10-1009, Okenshoji, Tokio, Japan) gelegt, um das Virus 5 Minuten lang zu adsorbieren. Die Gitter wurden mit DDW gewaschen und für eine weitere Minute auf einen Tropfen gefilterter 2,0 % Uranylacetatlösung gelegt, an der Luft getrocknet und mit einem JEM-1400 TEM (JEOL, Tokio, Japan) bei 80 kV untersucht.

Statistische Analysen wurden mit Graphpad Prism v9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung biologischer Triplikate dargestellt. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse durchgeführt. Für alle Datensätze wurde ein ap-Wert von weniger als 0,05 als signifikant angesehen.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Institutionellen Ethikkommission der Universität Hokkaido genehmigt (Genehmigungsnummer: 2021–2).

Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Enago (www.enago.jp) für die englischsprachige Rezension. Diese Arbeit wurde von JST SPRING, Fördernummer JPMJSP2119, unterstützt. Wir sind den Freiwilligen dankbar, die mit Zustimmung der Teilnehmer Speichel gespendet haben. Wir danken allen Mitgliedern des International Institute for Zoonosis Research für ihre hilfreichen Kommentare und Vorschläge.

Gefäßbiologie und Molekularpathologie, Fakultät für Zahnmedizin und Graduiertenschule für Zahnmedizin, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Ryo Takeda, Nako Maishi, Takuya Tsumita und Kyoko Hida

Orale Diagnose und Medizin, Fakultät für Zahnmedizin und Graduiertenschule für Zahnmedizin, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Ryo Takeda und Yoshimasa Kitagawa

Abteilung für Molekulare Pathobiologie, Internationales Institut für Zoonosekontrolle, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki und Yasuko Orba

International Collaboration Unit, International Institute for Zoonosis Control, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Hirofumi Sawa und Yasuko Orba

One Health Research Center, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Hirofumi Sawa

Unterstützungsabteilung für Bildung und Forschung, Graduate School of Dental Medicine, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Natsumi Ushijima

Community Service and Welfare Network, Hokkaido University Hospital, Sapporo, Japan

Yasuhiro Hida

Restaurative Zahnheilkunde, Fakultät für Zahnmedizin und Graduiertenschule für Zahnmedizin, Universität Hokkaido, Sapporo, Japan

Hidehiko Sano

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Konzeptualisierung, KH, HS, YK und HS; Methodik, MS und HS; Formale Analyse, Untersuchung, Datenkuration und -visualisierung, RT, MS und NU; Dateninterpretation, NM und TT; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, RT; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, HS, YO, YH und KH; Supervision, HS und KH; Projektverwaltung, HS und KH; Finanzierungseinwerbung, RT und KH Alle Autoren haben die eingereichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Kyoko Hida.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Takeda, R., Sawa, H., Sasaki, M. et al. Antivirale Wirkung von Cetylpyridiniumchlorid in Mundwasser auf SARS-CoV-2. Sci Rep 12, 14050 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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Eingegangen: 18. März 2022

Angenommen: 10. August 2022

Veröffentlicht: 18. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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