Eine mutmaßliche zytotoxische Serinprotease aus Salmonella typhimurium UcB5, gewonnen aus unzureichend gegartem Burger

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3926 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine mutmaßliche Virulenz-Exoprotease mit der Bezeichnung UcB5 wurde erfolgreich aus dem Bakterium Salmonella typhimurium bis zur elektrophoretischen Homogenität mit 13,2-facher und 17,1 %iger Ausbeute durch hydrophobe, Ionenaustausch- und Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Phenyl-Sepharose 6FF und DEAE-Sepharose CL-6B gereinigt bzw. Sephadex G-75. Durch Anwendung von SDS-PAGE wurde das Molekulargewicht bei 35 kDa bestätigt. Die optimale Temperatur, der pH-Wert und der isoelektrische Punkt lagen bei 35 °C, 8,0 bzw. 5,6 ± 0,2. Es wurde festgestellt, dass UcB5 eine breite Substratspezifität gegenüber fast allen getesteten chromogenen Substraten aufweist, wobei die maximale Affinität gegenüber N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Km von 0,16 mM und Kcat/Km von 3,01 × 105 S−1 M erreicht −1 und eine amidolytische Aktivität von 28,9 µmol min−1 L−1. Es wurde durch TLCK, PMSF, SBTI und Aprotinin drastisch gehemmt, während DTT, β-Mercaptoethanol, 2,2′-Bipyridin, o-Phenanthrolin, EDTA und EGTA keine Wirkung hatten, was auf einen Serinprotease-Typ schließen lässt. Darüber hinaus zeigte es eine breite Substratspezifität gegenüber einem breiten Spektrum natürlicher Proteine, einschließlich Serumproteinen. Eine Zytotoxizitäts- und Elektronenmikroskopie-Studie ergab, dass UcB5 eine subzelluläre Proteolyse verursachen könnte, die schließlich zu einer Lebernekrose führte. Zu diesem Zweck sollte sich die zukünftige Forschung auf den Einsatz einer Kombination aus externen Antiproteasen und antimikrobiellen Wirkstoffen zur Behandlung mikrobieller Erkrankungen konzentrieren, anstatt nur Medikamente einzusetzen.

Toxine und Enzyme wirken als wichtige Virulenzmittel bei der mikrobiellen Pathogenese im erkrankten Wirt1,2. Bakterielle Toxine sind vollständig charakterisiert und ihre Rolle im Pathogeneseprozess ist gut untersucht, wohingegen die Rolle mikrobieller Proteasen bei der Pathogenese von Tieren und Pflanzen nicht gut untersucht ist. Dies könnte auf die Komplexität der Enzyme und die mangelnde Selektivität im Vergleich zu Toxinen zurückzuführen sein3. Proteasen wurden schon vor langer Zeit in den Zellextrakten vieler pathogener Bakterien identifiziert4. Es mag überraschen, dass die meisten von ihnen lange Zeit unbekannt waren und erst vor Kurzem genau definiert wurden. Mikroben produzieren viele Arten von Proteasen, die in Serin-, Metallo-, Asparaginsäure- und Cystein-Typen kategorisiert werden. Einige von ihnen werden spezifisch durch Plasma-Protease-Inhibitoren, sogenannte Serpine, gehemmt, während die meisten von ihnen resistent gegen menschliche Plasma-Antiproteasen sind oder diese inaktivieren. Dies hat zur Folge, dass diese, sobald sie sich im Körper befinden, die Verarbeitung von Krankheiten und Beeinträchtigungen des Wirts beschleunigen5.

Ihre Beteiligung an der Virulenz wurde mit einer Vielzahl von Methoden in Verbindung gebracht. Um den Invasionsprozess einzuleiten oder Wirtsproteine zu verdauen, um Zugang zu peptidischen Nährstoffen zu erhalten, proteolysieren und zerstören sie zunächst Wirtsgewebe. Durch die Beeinträchtigung von Zellsignalproteinen oder proteolysierenden Proteinen der Matrixkomponenten erleichtert die HtrA-Protease beispielsweise zunächst die Ausbreitung von Krankheiten. Zweitens können sie Untereinheitstoxine (AB-Toxine) aktivieren, indem sie die aktive Einheit (A-Untereinheit) von der Bindungseinheit (B-Untereinheit) abspalten. Drittens wirken einige von ihnen wie Clp- und Lon-Proteasen direkt im Zytosol, indem sie rechtzeitig die Virulenzkontroller zerstören, und indirekt, indem sie den inneren antagonistischen Komponenten wie Superoxiden und freien Radikalen Widerstand leisten, um die Immuneffektorkomponenten des Wirts gegen die Infektion zu stoppen bakterieller Erreger6.

S. enterica mit mehr als 2000 Serovaren kann viele verschiedene Krankheiten verursachen. Die Serovare Enteritidis und Typhimurium sind die häufigste Ursache für Gastroenteritis beim Menschen, während andere Serovare wie S. typhi die Hauptursache für tödliche systemische Erkrankungen sind. Interessanterweise handelt es sich bei Mutanten des Serovars Typhimurium, denen clpP- oder clpX-Proteasen fehlen, um nicht virulente Stämme, was auf die Bedeutung der ClpXP-Protease bei der Salmonellose hinweist7. Darüber hinaus reagieren Serovarmutanten, denen die Lon-Protease fehlt, sehr empfindlich auf H2O2 und Säure und sind daher nicht in der Lage, in Makrophagen zu überleben und sich in distalen Teilen des Körpers zu vermehren und Krankheiten auszulösen8. Es wurde festgestellt, dass die Peptidase N des Serovars Typhimurium die primäre Aminopeptidase in Zytosolen mit einem breiten Spektrum an Substrataktivität ist9.

Derzeit sind Infektionen durch Salmonellen-Serovare nach wie vor gefährlich, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, wo sie zusammen mit vielen kontaminierten Lebensmitteln verzehrt werden können und zu lokalen pathologischen Zuständen im Verdauungstrakt führen, die sich auf andere ausbreiten können systemische Infektion10. Leider fehlt eine detaillierte Charakterisierung der Salmonella-Proteasen. Daher wollten wir in erster Linie die proteolytischen und hämolytischen Aktivitäten von Salmonella- und Shigella-Isolaten überwachen, die lokale Lebensmittelproben begleiten. Das Ziel dieses Teils der Forschung wurde erweitert, um die Enzymeigenschaften und die zellulären Veränderungen von Säugetierzellen aufzudecken, die durch die UcB5-Protease verursacht werden, die vom wirksamsten Isolat, S. typhimurium, produziert wird.

DTT, SBTI und EAM wurden von Merck (Peking, China) bezogen. Fibrin, Fibrinogen, pNA, PMSF, DMSO, EGTA, PHMB, Leupeptin und Pepstatin A wurden von Sigma-Aldrich (MO, USA) bezogen. Chromogene synthetische Substrate wie D-Val-Leu-Arg-pNA (V6258), D-Val-Leu-Lys-pNA (V7127), D-Phe-Pip-Arg-pNA (P7027) und N-Succ-Ala -Ala-Pro-Phe-pNA (S7388) wurden ebenfalls von Sigma-Aldrich bezogen. Die humane Adenokarzinomzelllinie HT29 wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) erworben. Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B, Sephadex G-75 und Markerproteine wurden von Amersham Biosciences (Schweden) bezogen. Bei den übrigen Chemikalien handelte es sich um analytische Qualität von ansässigen Anbietern.

Der untersuchte Bakterienstamm wurde ursprünglich aus einer Probe eines unzureichend gegarten Rindfleischburgers gewonnen, die auf einem lokalen traditionellen Markt gekauft wurde. Dieser Stamm zeigte die höchste proteolytische und hämolytische Aktivität unter insgesamt vierzehn Bakterienisolaten, die aus verschiedenen Lebensmittelproben, einschließlich verarbeitetem Fleisch und Milchprodukten, gewonnen wurden. Die differenzielle Isolierung dieser Bakterien wurde auf Salmonella-Shigella (SS)-Agarplatten (Himedia, Indien), ergänzt mit 1 % Magermilch bei pH 7,0, durchgeführt. Anschließend wurden die Schalen 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Gelöschte Lichthöfe um die Kolonien weisen auf proteolytische Aktivität hin. Für das Screening der hämolytischen Aktivität wurde SS-Agar, ergänzt mit 10 % citriertem Schafsblut, verwendet. Halo-Zonen um Bakterienkolonien herum deuteten auf eine hämolytische Aktivität hin. Basierend auf diesem Screening-Programm wurde das Isolat Nummer fünf, das aus einer Probe von ungekochtem Rindfleisch-Burger isoliert wurde, ausgewählt und anhand des 16SrDNA-Gen-Fingerabdrucks und der Durchführung einer BLAST-Analyse in der GenBank-Datenbank bis auf Speziesebene identifiziert. Kurzzeitbakterienkulturen wurden auf Nähragar bei 4 °C konserviert, während Langzeitkulturen bei –80 °C in 20 % (v/v) glycerierter Brühe konserviert wurden.

Inokula der Stammnummer UcB5 wurden regelmäßig in LB-Brühe bestehend aus (g/L) NaCl 5,0, Hefeextrakt 5,0 und Trypton 10,0 mit pH 7,0 subkultiviert. Genau ein Prozent (v/v) des 12 Stunden alten Inokulums (~ 3 × 108 KBE/ml) wurde bei pH 7,0 in die Fermentationsbrühe transportiert. Das Basismedium bestand aus (w/v) 1 % Fructose, 0,5 % NaCl, 0,5 % Pepton, 0,15 % MgSO4·7H2O, 0,08 % KH2PO4, 0,02 % K2HPO4, 0,005 % CuSO4 und 0,001 % FeSO4. Die Inkubation erfolgte unter einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C für 48 Stunden in 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml Brühe.

Die proteolytische Aktivität wurde durch Mischen von 1 ml Kulturüberstand und 1 ml 1 % (Gew./Vol.) Azocaseinlösung, gelöst in 0,2 M Tris-HCl-Puffer mit pH 7,0, bewertet. Die Enzym-Substrat-Reaktion ließ man 30 Minuten lang bei 37 °C ablaufen und wurde durch die Zugabe von 2 ml 10 % (Gew./Vol.) Trichloressigsäurelösung beendet. Anschließend Inkubation für 60 Minuten in einem Eisbad. Nach dieser Berechnung wurde die Menge an löslichen Abbauproteinen (C) gemessen (mg/ml); C (mg/ml) = 1,55 OD280 − 0,76 OD260. Eine Einheit (1 U) proteolytische Enzymaktivität entsprach einem Mikrogramm freigesetztem L-Tyrosin pro Milliliter und Minute der Reaktion unter den Standardbedingungen der Experimente.

Die Rohprotease wurde unter Kühlung bei 4 °C über vier Stufen gereinigt, bestehend aus (NH4)2SO4-Salzfällung, hydrophober Phenyl-Sepharose-6FF-Chromatographie, DEAE-Sepharose-CL-6B-Anionenaustauschchromatographie und Sephadex-G-75-Gelpermeationschromatographie. Zunächst wurde die Kulturbrühe 10 Minuten lang bei 7000 × g zentrifugiert, dann erfolgte die Zugabe von (NH4)2SO4 bei 30–70 % Sättigung. Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 10.000 × g für 15 Minuten, um die löslichen Proteine zu ernten. Pelletierte Rohprotease und andere Proteine wurden dann bei pH 7,8 in Puffer A (20 mM Tris-HCl, bestehend aus 1,0 M )NH4)2SO4 resuspendiert. Nach der Entfernung der Schwebstoffe und dem Dialyseschritt wurde die konzentrierte Rohprotease in eine Phenyl Sepharose 6 FF-Säule mit einer Abmessung von 1,5 × 20 cm2 geladen. Anschließend wurde zur Elution der Proteine ein linearer Anstieg von 0,5–0,0 M (NH4)2SO4 in Puffer A angewendet. Aus diesem Elutionschromatogramm wurden aktive Fraktionen, die enzymatische Aktivität zeigten, gepoolt und konzentriert. Anschließend wird es auf die nächste Säule geladen, die aus DEAE-Sepharose CL-6B mit einer Abmessung von 1,5 × 15 cm2 besteht. Die Elution erfolgte mit einer Flussrate von 0,5 ml/min bei pH 9,4 und 20 mM Tris-HCl-Puffer (Puffer B). Aktive Fraktionen, die proteolytische Aktivität zeigten, wurden dann konzentriert, mit Puffer B dialysiert und in die nächste Säule geladen, die Sephadex G-75 FF mit einer Abmessung von 1,5 × 30 cm2 enthielt. Die Elution erfolgte mit Puffer A. Die endgültigen proteaseaktiven Fraktionen wurden lyophilisiert und die SDS-PAGE wurde mit der Universaltechnik von Laemmli11 unter Verwendung von 15 % (Gew./Vol.) Trenngel und 5 % (Gew./Vol.) Stapelgel durchgeführt.

Der Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität wurde bei 20–65 °C unter Verwendung von 1 % (Gew./Vol.) Azocasein in 0,2 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, untersucht. Um andererseits die thermische Stabilität zu untersuchen, wurde eine getestete Proteaselösung in 0,2 M Tris-HCl (pH 7,0) 60 Minuten lang bei 20 bis 65 °C stehen gelassen. Am Ende der Inkubation wurden die Behandlungen dann abgekühlt, um die verbleibende Proteaseaktivität bei den typischen Einstellungen eines Enzymassays zu bestimmen.

Um den Einfluss des pH-Werts auf die proteolytische Aktivität von UcB5 zu untersuchen, wurden die reagierenden Lösungen durch drei Puffer auf einen breiten pH-Bereich fixiert. Citrat-Phosphat-Puffer zum Erreichen eines pH-Bereichs von 3,0 bis 6,0, Tris-HCl-Puffer für pH-Werte im Bereich von 7,0 bis 8,0 und Glycin-NaOH-Puffer zur Einstellung von pH-Werten im Bereich von 9,0 bis 13,0. Es wurde Azocasein in einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) verwendet und die Inkubation der Enzym-Substrat-Reaktionen erfolgte bei 35 °C.

Um die pH-Stabilität des reinen Enzyms zu untersuchen, wurde es 60 Minuten lang bei 35 °C mit verschiedenen pH-Werten im Bereich von 5,0 bis 13,0 unter Verwendung der vorgeschriebenen Puffer inkubiert. Die verbleibende enzymatische Aktivität wurde bei pH 8,0 beurteilt. Darüber hinaus wurde der isoelektrische Punkt der getesteten Protease durch Inkubation einer konzentrierten Zubereitung des reinen Enzyms über Nacht bei pH-Werten im Bereich von 3,0 bis 11,0 und 4 °C bestimmt. Die Proteinfällung erfolgte 15 Minuten lang bei einer Schwerkraft von 10.000 × g. Die Proteinpellets wurden gemäß der Bradford12-Methode quantifiziert. Der isoelektrische Punkt wurde als pH-Wert ausgedrückt, bei dem die maximale Proteinausfällung erfolgt ist13.

Diese wurden kolorimetrisch gegen mehrere chromogene Peptide als synthetische Substrate wie P7021, V7127, S7388 und V6258 bestimmt. Für Experimente wurde jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 5 µl Enzymlösung in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 100 µl eines synthetischen Substrats in einer spezifischen Konzentration von 0,02 bis 0,15 mM beladen. Die Reaktion wurde bei 37 °C durchgeführt und in bestimmten Zeitabständen durch Zugabe von 1,4 ml 0,15 M Trichloressigsäure beendet. Die Menge an freigesetzter pNA wurde spektrophotometrisch bei A405 nm geschätzt. Eine Einheit (1 U) amidolytische Aktivität der Protease wurde auf nmol des chromogenen Substrats kalibriert, das aufgrund der Wirkung der getesteten Protease pro Minute und ml abgebaut wurde. Die kinetischen Parameter wurden anhand der Lineweaver-Burk-Diagramme in Abhängigkeit von der Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion geschätzt.

Um die Gruppe zu definieren, zu der das gereinigte UcB5 gehört, wurde der Einfluss verschiedener Metallionen und Standardreagenzien auf seine amidolytische Aktivität untersucht. In einer Mikrotiterplatte wurden diese mit 1,0 × 10–4 mg des chromogenen Substrats S7388 und 2,0 × 10–3 mg des Enzyms in 100 µl 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gemischt und 3 Minuten bei 37 °C inkubiert °C. Die freigesetzte pNA wurde durch die spektrophotometrische Messung bei A405 quantifiziert.

Für Metallionenexperimente wurden sie in parallelen Tests bei einer Konzentration von 5 mM getestet. Die verwendeten Konzentrationen der Proteasereagenzien variierten je nach zitierter Literatur (siehe Ergebnisse). Die Enzymaktivität bei der Behandlung ohne Reagenzien und Kationen wurde als 100 % angesehen.

Die Substratspezifität von UcB5 gegenüber natürlichen Proteinsubstraten wurde bei einer Konzentration von 0,5 % (Gew./Vol.) nach dem Verfahren von Peng et al.14 untersucht. Dazu gehören Kasein, Elastin, Hämoglobin, Fibrin, Gelatine, Fibrinogen, Kollagen, Mucin, IgG und Serumalbumin. Dies wurde anhand mehrerer natürlicher Proteine ermittelt. Eine Einheit (1 U) proteolytische Aktivität wurde als die Enzymmenge kalibriert, die unter den Standardbedingungen des Tests vergleichbar mit 1 µmol der Aminosäure Tyrosin pro Milliliter und Minute freisetzt.

Die nächsten Experimente wurden von einer entsprechenden Institution genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Methoden gemäß den relevanten Richtlinien und Vorschriften einschließlich der ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Die gerinnungshemmende In-vitro-Aktivität wurde als Verlängerung der Gerinnungsdauer von menschlichem Blutserum bei Vorhandensein von 15 µg UcB5-Protease/ml15 untersucht. Genauer gesagt wurden 100 µl Blutserum mit äquivalenten Volumina von Thromboplastin und Kaolin verrührt. Nach 2-minütiger Inkubation bei 37 °C im Wasserbad wurden genau 100 µl 0,3 % (w/v) CaCl2 und 100 µl des Enzyms zugegeben. Anschließend wurde die Gerinnungszeit in Gegenwart des Enzyms im Vergleich zu Blindproben bestimmt, die anstelle des gereinigten Enzyms eine äquivalente Menge physiologischer Kochsalzlösung enthielten.

Der In-vitro-Zytotoxizitätstest der gereinigten Protease von S. typhimurium gegen die menschliche Adenokarzinomzelllinie HT29 (Merck, Darmstadt, Deutschland) wurde auf einer 96-Well-Platte durch 24-stündige Inkubation durchgeführt. Pro 1 × 105 HT29-Zellen pro Milliliter wurden fünfzehn Mikrogramm des Enzyms verwendet. Am Ende der Inkubation wurde der prozentuale Zelltod von HT29 mit dem Standard-MTT-Assay16 ermittelt. Für negative Blindproben wurde physiologische Kochsalzlösung anstelle der aktiven Proteasepräparate verwendet, während für Blindproben ein Medium ohne Zellen verwendet wurde. Die Idee dieses Tests besteht darin, dass die verbleibenden überlebenden Zellen das gelbe Tetrazolium-MTT-Reagens in den violetten Formazan-Komplex mit einer charakteristischen Absorption bei A540 nm umwandeln können, was auf die Lebensfähigkeit von HT29 hinweist. Die Intensität der violetten Farbe steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der überlebenden Zellen nach der Exposition gegenüber UcB5.

Darüber hinaus wurde ein Test der zellschädigenden Aktivität gegen Erythrozyten (hämolytische Aktivität) aufgrund des gereinigten Enzyms durchgeführt. Dies wurde durch Vortexen identischer Volumengrößen von 15 µg Protease/ml und 4 % (v/v) gewaschenen menschlichen Erythrozyten erreicht, die in 0,1 M Boratpuffer, pH 7,5, suspendiert waren. Die Inkubation erfolgte 90 Minuten lang bei 37 °C, danach wurde die Menge des freigesetzten Hämoglobins kolorimetrisch gemessen. Zum Vergleich wurde eine vollständige Hämolysebehandlung durch Mischen der Erythrozytensuspension mit 1 % (v/v) Triton X-100-Lösung durchgeführt.

Außerdem wurde ein In-vivo-Screening auf zellschädigende Aktivität durchgeführt und der LD50-Wert berechnet. Zu diesem Zweck wurden BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g eine Woche lang an die Laborbedingungen gewöhnt und unter relativ festen Ernährungs- und physikalischen Bedingungen gehalten. Anschließend wurden sie in sechs Gruppen zu je sechs Tieren pro Käfig eingeteilt. Die erste Gruppe wurde als universelle Leergruppe dargestellt. Mäuse dieser Gruppe wurden intraperitoneal mit einem gleichen Volumen eines hitzedenaturierten Enzympräparats in einer Konzentration von 60 µg/Körpergewicht geimpft. Während den anderen fünf Gruppen das aktive Proteasepräparat in verschiedenen Konzentrationen (60, 30, 15, 8 und 4 µg Protease/Körpergewicht) in einem Gesamtvolumen von 1 ml Lösung intraperitoneal injiziert wurde. Anschließend wurden die Tiere in Zeitintervallen über 48 Stunden hinweg für die LD50-Berechnung nach der Methode von Karber beobachtet. Die Lebern betroffener und leerer Mäuse wurden unmittelbar nach dem Tod entnommen und in 5 % (v/v) Glutaraldehyd und dann 1 % (w/v) OsO4-Lösung fixiert. Vor der Sektion einer leeren Maus wurde diese mit dem Inhalationsgas Sevofluran betäubt. Ultradünne Schnitte von 70 nm wurden mit einem RMC-Ultramikrotom geschnitten und zur Untersuchung unter dem JEOL 1010 TEM auf Standard-TEM-Stützgitter aus Kupfer geladen.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Messungen und Behandlungen dreifach durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS Statistics V24 durchgeführt. Die endgültigen Messwerte wurden in Form von Durchschnittswerten ± Standardabweichungen dargestellt.

Die In-vivo-Studie wurde mit der Genehmigung Nr. 5/2019EC des Experimental Animals Care Ethics Committee der Kafrelsheikh University, Ägypten, durchgeführt. Darüber hinaus wurden alle Methoden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften einschließlich der ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Während einer vorläufigen Untersuchung von Salmonella- und/oder Shigella-Isolaten, die sowohl proteolytische als auch hämolytische Aktivität ausüben, isolierten wir insgesamt vierzehn Isolate auf SS-Agar, ergänzt mit Magermilch. Diese wurden ursprünglich aus dreißig Lebensmittelproben gewonnen, die auf einigen lokalen Märkten gesammelt wurden. Der stärkste Produzent unter ihnen war das Isolat Nummer fünf, das aus einer Probe von ungekochtem Rindfleisch-Burger isoliert wurde. Daher wurde er als Stamm UcB5 bezeichnet. Die 16SrDNA-Gensequenzierungsdaten und die BLAST-Analyse zeigten, dass der Stamm UcB5 S. typhimurium mit 98,86 % ähnlicher Identität mit einer bestehenden Gattung und Art war. Die Nukleotidsequenz wurde in der GenBank Records Library unter der Zugangsnummer (MH340533.1) aufgeführt.

Das Bakterienwachstum und die UcB5-Proteaseproduktion des stärksten Stammes waren während der gesamten Fermentationsperiode (96 Stunden) synchronisiert. Sie erreichten die maximalen Werte nach 48 Stunden Inkubation, wobei das Bakterienwachstum eine optische Dichte von 1,32 bei einer Wellenlänge von 600 nm erreichte und die Enzymproduktivität 125,2 U/ml erreichte (Abb. 1).

Verhältnis der Proteaseproduktion (-■-) und der Wachstumsphase (-○-) in einer Kultur von S. typhimurium, gewachsen in einem Basismedium bestehend aus (w/v) 1 % Fructose, 0,5 % Pepton, 0,5 % NaCl, 0,15 % MgSO4·7H2O, 0,08 % KH2PO4, 0,02 % K2HPO4, 0,005 % CuSO4 und 0,001 % FeSO4. Die Fermentation erfolgte auf einem Rotationsschüttler bei einer Geschwindigkeit von 150 U/min bei 37 °C und einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 für 48 Stunden. Es besteht eine äußerst positive Korrelation zwischen Bakterienwachstum und Enzymproduktivität, da der Korrelationskoeffizient r = 0,886*** beträgt. Der zweiseitige P-Wert wird mit 0,00 angegeben, dies ergibt eine sehr hochsignifikante lineare Korrelation.

Wie in Tabelle 1 erläutert, wurde das UcB5-Enzym aus S. typhimurium-Flüssigkulturen durch verschiedene Schritte, einschließlich hydrophober Chromatographie, Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographie durch Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B usw., effizient bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt Sephadex G-75 bzw. Die endgültige spezifische Aktivität des Enzyms wurde auf das 13,2-fache erhöht und die Ausbeute betrug 17,1 %. Die elektrophoretische Homogenität des getesteten Enzyms spiegelte sich im Hauptpeak der Proteaseaktivität wider, der die Fraktionen 18–42 umfasste und im letzten chromatographischen Schritt erhalten wurde. Nach der Konzentration dieser Fraktionen wurde eine SDS-PAGE durchgeführt (Abb. 2a), bei der eine deutliche Bande bei 35 kDa zu sehen war (Abb. 2b). Die vorherige Version des SDS-PAGE-Gels ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Elutionsprofil von UcB5 durch Sephadex G-75 (a) und SDS-PAGE (b). Zunächst wurden die Kulturproteine mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 30–70 % ausgefällt und dann auf eine Phenyl-Sepharose-6FF-Säule (1,5 × 20 cm2) und anschließend auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (1,5 × 20 cm2) geladen. und eine Sephadex G-75 FF-Säule (2,5 × 100 cm2). Abschließend wurde die SDS-PAGE-Analyse mit 5 % (Gew./Vol.) Stapelgel und 15 % (Gew./Vol.) Trenngel durchgeführt. Das Gel wird mit einer Malsoftware zugeschnitten und die vorherige Gelversion ist in der Zusatzinformationsdatei zu finden.

Die beste Reaktionstemperatur für die proteolytische Aktivität von UcB5 gegenüber dem Substrat Azocasein wurde bei 35 °C ermittelt (Abb. 3). Darüber hinaus war das Enzym 60 Minuten lang unter 55 °C thermisch stabil. Bei 50 °C behielt es 84 % seiner ursprünglichen Aktivität. Der ideale pH-Wert für die proteolytische Aktivität von UcB5 gegenüber dem Substrat wurde bei pH 8,0 eingestellt (Abb. 4a). Darüber hinaus wurde die pH-Stabilität von UcB5 für 60 Minuten bei 8,0 bis 11,0 festgestellt (Abb. 4a). Bei pH 8,0–11,0 behielt das Enzym 92 % seiner ursprünglichen Aktivität. Wie aus der Proteinfällung hervorgeht, wurde der isoelektrische Punkt für die Proteinstruktur dieses Enzyms bei pH 5,6 ± 0,2 gefunden. Die Niederschlagsmenge erreichte 1,8 mg Protein/ml (Abb. 4b).

Einfluss der Temperatur sowohl auf die proteolytische Aktivität (-●-) als auch auf die Stabilität (-○-). Der Temperatureinfluss auf die enzymatische Aktivität wurde bei pH 7,0 mit 0,2 M Tris-HCl-Puffer unter Verwendung des Substrats Azocasein getestet. Die Temperaturstabilität von UcB5 wurde durch 60-minütige Inkubation ohne Substrat in 0,2 M Tris-HCl (pH 7,0) untersucht. Am Ende der Inkubation wurde die verbleibende Aktivität bewertet. Es besteht eine sehr positive Korrelation zwischen der Enzymaktivität und ihrer thermischen Stabilität, da der Korrelationskoeffizient r = 0,738** beträgt. Der zweiseitige P-Wert wird mit 0,015 angegeben, was eine hochsignifikante lineare Korrelation ergibt. Zwar besteht eine stark negative Korrelation zwischen der Enzymstabilität und der Temperatur, die sich aus dem Korrelationskoeffizienten r = − 0,915*** ergibt. Der zweiseitige P-Wert wird mit 0,000 angegeben, dies ergibt eine sehr hochsignifikante lineare Korrelation. Die geschätzte Regressionsgleichung kann als Enzymstabilität = 139,9–1,47 Temperatur ausgedrückt werden.

Einfluss des pH-Werts sowohl auf die proteolytische Aktivität (-●-) als auch auf die Stabilität (-○-) (a). Die Reaktionstemperatur wurde in Gegenwart von Azocasein auf 35 °C eingestellt. Die pH-Stabilität des reinen Enzyms wurde durch 60-minütige Inkubation ohne Substrat bei 35 °C und verschiedenen pH-Werten überprüft. Anschließend wurde die verbleibende enzymatische Aktivität bei einem pH-Wert von 8,0 bewertet. Der isoelektrische pH-Wert basierend auf dem Proteinfällungsmuster ist in (b) dargestellt. Es besteht eine schwache positive Korrelation zwischen der Enzymaktivität und ihrer pH-Stabilität, da der Korrelationskoeffizient r = 0,487 ist. Der zweiseitige P-Wert wird mit 0,109 angegeben. Es besteht eine schwache negative Korrelation zwischen dem pH-Wert und dem ausgefällten Protein, da der Korrelationskoeffizient r = − 556*** ist. Der zweiseitige P-Wert wird mit 0,000 angegeben und die geschätzte Regressionsgleichung kann als Proteingehalt = 1,522–0,122 pH ausgedrückt werden.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass das Enzym unterschiedliche Grade an amidolytischer Aktivität gegenüber den getesteten chromogenen Substraten zeigte (Tabelle 2). Das Standard-Proteasesubstrat für Chymotrypsin- und Subtilisin-Proteasen, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, war das am weitesten vom UcB5 abgebaute Substrat und zeigte eine amidolytische Aktivität von 28,9 µmol min−1 L−1. Außerdem hat UcB5 das chromogene Substrat D-Val-Leu-Lys-pNA und D-Phe-Pip-Arg-pNA abgebaut. Allerdings zeigte es die geringste Wirkung gegen D-Val-Leu-Arg-pNA. Die kinetischen Parameter für das UcB5-gegen-N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA-Substrat waren: Km von 0,16 mM und Kcat/Km von 301 mM−1 S−1.

Die Untersuchung der Wirkung von Proteasereagenzien und -kationen auf die Enzymaktivität (Tabelle 3) bietet ein erstes Verständnis der Natur des getesteten Enzyms, der Natur des aktiven Zentrums und der Cofaktorversorgung. Bei der Untersuchung des Einflusses von Kationen auf die amidolytische Aktivität wurde festgestellt, dass keines von ihnen ein Aktivator für das Enzym war. Die amidolytische Aktivität in Abwesenheit von Metallen wurde als 100 % angesehen, daher betrug die relative Aktivität 92 % für Ba2+, 87 % für Co2+, 62 % für Zn2+, 102 % für Fe3+, 84 % für Ca2+, 98 % für Mg2+, 65 % für Cu2+, 49 % für Mn2+, 67 % für Cd2+, 103 % für Ag2+ und 47 % für Hg2+-Ionen.

Bezüglich der Wirkung von Proteasereagenzien wurde festgestellt, dass die Proteaseaktivität von UcB5 durch TLCK (1,2 % relative Aktivität), PMSF (17,3 % relative Aktivität), SBTI (31,3 % relative Aktivität) und Aprotinin (3,0 % relative Aktivität) gehemmt wurde. , Pepstatin A (15,7 % relative Aktivität) und Leupeptin (78,5 % relative Aktivität), wurde jedoch nicht durch 2,2′-Bipyridin (102,2 % relative Aktivität), DTT (100,5 % relative Aktivität), o-Phenanthrolin (99,5 % relative Aktivität) beeinflusst. relative Aktivität), β-Mercaptoethanol (98,9 % relative Aktivität) und die beiden Metalloprotease-Inhibitoren EDTA (100,1 % relative Aktivität) und EGTA (100,2 % relative Aktivität) (Tabelle 2). Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Mercaptidbildner PHMB (99,7 % relative Aktivität) und EAM (102,1 % relative Aktivität) keinen Einfluss auf die proteolytische Aktivität hatten.

Dies wurde anhand mehrerer natürlicher Proteine bei einer Konzentration von 0,5 % (Gew./Vol.) bestimmt. Wenn man davon ausgeht, dass die Aktivität von UcB5 gegen Kasein 100 % betrug, betrugen die relativen Aktivitäten gegen Fibrin, Gelatine, Mucin, Hämoglobin, Fibrinogen, Elastin, Kollagen, IgG und Serumalbumin 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5. 0,0 bzw. 12,7 %. Die proteolytische Wirkung gegen Plasmaproteine wurde auch im nächsten Experiment bei der Prüfung der gerinnungshemmenden Aktivität bestätigt (Ergänzungstabelle S1). In Gegenwart von UcB5 verlängerte sich die Gerinnungszeit des Blutserums auf 81 s, was dem 3,5-fachen der Gerinnungszeit ohne Enzym entspricht.

Während des in der Ergänzungstabelle S1 dargestellten In-vitro-Experimentes zeigte UcB5 in einer Dosis von 15 µg Enzym/ml einen Zelltod von 63,8 % der kultivierten HT29-Zelllinie. Außerdem löste es einen 3,9-fachen Anstieg der Hämolyse roter Blutkörperchen aus. Darüber hinaus wurde eine vergleichende In-vivo-Studie mit einem aktiven und einem hitzeinaktivierten Proteasepräparat durchgeführt, um festzustellen, ob ein Zusammenhang zwischen dessen Toxizität und enzymatischer Aktivität besteht. Die aktiven Präparate wurden mit 60 µg bis 4 µg Protease/Mauskörpergewicht eingesetzt (Ergänzungstabelle S2). Bei Konzentrationen von 60 µg und 30 µg kam es bei allen getesteten Tieren innerhalb von 2 Stunden zum Tod, während bei Behandlungen mit 15 µg bzw. 8 µg 4 bzw. 1 von sechs Mäusen innerhalb von 48 Stunden starben. Bei einer Behandlung mit 4 µg des Enzyms wurde keine Letalität festgestellt. Andererseits wurde keine der Mäuse durch das hitzeinaktivierte Enzympräparat getötet. Die berechnete LD50 nach 48 Stunden betrug 15,75 µg Protease/Mauskörpergewicht (Ergänzungstabelle S2).

Die TEM-Studie an den betroffenen Mäusen ergab, dass UcB5 eine Bläschenbildung (V) innerhalb der Hepatozyten induziert hat und die Kernmembran (nm) durch die Ansammlung von Heterochromatin (Hc) deformiert wurde. Die Zellmembran und das raue endoplasmatische Retikulum (ER) der Hepatozyten verschwanden vollständig (Abb. 5).

TEM-Aufnahmen, die die ultrastrukturellen Veränderungen in den Hepatozyten von behandelten Mäusen und Kontrollmäusen zeigen. (a) Ein typischer Hepatozyten zeigt eine intakte Zellmembran (cm) und eine intakte Kernmembran (nm), die Euchromatin (Ec) enthält. Außerdem zeigt es ein intaktes raues endoplasmatisches Retikulum (ER) und ausgedehnte normale Mitochondrien (M). (b) Eine Leberzelle einer Maus, die ein aktives Präparat der UcB5-Protease erhalten hat. Es zeigt eine Bläschenbildung (V) und eine deformierte Kernmembran (nm) mit Heterochromatin (Hc). Es zeigt das Verschwinden der Zellmembran und des rauen endoplasmatischen Retikulums. Die zellschädigende Aktivität in vivo wurde durch Experimente mit BALB/c-Mäusen, die in sechs Gruppen gehalten wurden, bewertet. Kurz gesagt, wurde jeder Maus auf intraperitonealem Weg gereinigtes UcB5 in einem Gesamtvolumen von 1 ml inokuliert. Jede Maus wurde mit einem hitzeinaktivierten Enzympräparat für die universelle Kontrollgruppe geimpft. Den getöteten Tieren und den Kontrolltieren wurden Lebern entnommen und fixiert. Schließlich wurden ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 70 nm mit dem RMC-Ultramikrotom aufgenommen und auf Kupfergittern zur elektronenmikroskopischen Untersuchung unter dem JEOL 1010 TEM befestigt.

Laut mehreren veröffentlichten Forschungsergebnissen hängt die Fähigkeit pathogener Mikroorganismen, Krankheiten zu verursachen, von der Entwicklung extrazellulärer Proteasen ab. Obwohl die genaue Wirkungsweise unklar ist, scheint es, dass diese mikrobiellen Enzyme in das Proteasesystem des Wirts eingreifen17. In unseren früheren Studien haben wir über die Pathogenese der KB76-Protease von Brevibacterium otitidis18 und der ZuhP13-Protease von Pseudomonas aeruginosa17 berichtet. In dieser Arbeit haben wir ein mögliches zytotoxisches Enzym namens UcB5-Protease aus dem Bakterium S. typhimurium abgetrennt und charakterisiert.

Der wirksamste Protease-produzierende Stamm, Stamm UcB5, wurde anhand der 16S-rDNA-Gensequenzierungsdaten als S. typhimurium identifiziert. Nach 48 Stunden Inkubation waren die UcB5-Proteaseproduktion (125 U/ml) und das Bakterienwachstum auf höchstem Niveau synchronisiert (Abb. 1). Daraus lässt sich schließen, dass die UcB5-Protease ebenso wie die ZuhP13-Protease von P. aeruginosa ein Hauptenzym ist, das für die Bakterienentwicklung benötigt wird17. Im Gegensatz zur Protease des Fischpathogens zeigte Yersinia ruckeri nach 12:19 Uhr die beste Produktivität. Interessanterweise wurde UcB5 in einem Basismedium ohne das Substrat Casein produziert (siehe Materialien und Methoden), was ein Hinweis auf ein konstitutives, nicht induzierbares Enzym ist.

Die endgültige spezifische Aktivität des isolierten Enzyms erhöhte sich um das 13,2-fache, mit einer Erholung von 17,1 %. SDS-PAGE der letzten Säulenproteine (Abb. 2a) zeigte eine deutliche Bande bei 35 kDa (Abb. 2b). Diese Molekülmasse stimmt mit den pathologischen Proteasen von P. aeruginosa20 überein, während im Gegensatz zu den Proteasen von Legionella pneumophila (38 kDa21), Vibrio pelagius (39 kDa22), Vibrio parahaemolyticus (43 kDa23) Br. otitidis (47 kDa18) und Y. ruckeri (47 kDa19).

Ähnlich wie bei der virulenten Protease von Y. ruckeri19 erwies sich 35 °C als optimale Reaktionstemperatur für die proteolytische Aktivität von UcB5 (Abb. 3). Während 40 °C für die ZuhP13-Protease17 am besten war, und 50 °C für die ME4-Protease24. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass UcB5 60 Minuten lang unter 55 °C hitzestabil ist (Abb. 3). Der Literatur zufolge ist es bei der Bewertung mit der virulenten Protease von Y. ruckeri hitzestabiler (vollständige Hemmung bei 55 °C19) und temperaturlabiler im Vergleich zur San-ai-Protease von P. aeruginosa (stabil bei 60 °C für). 90 Min.25.

Es wurde gezeigt, dass die proteolytische Aktivität von UcB5 bei pH 8,0 am besten ist (Abb. 4a), was den pathologischen Proteasen von Y. ruckeri19, Bacillus cereus-Stamm BG126 und Stamm KCTC 367427 ähnelt. Der starke Rückgang der proteolytischen Aktivität bei niedrigerem pH-Wert Werte können darauf zurückzuführen sein, dass die niedrigeren pH-Werte mit dem isoelektrischen Punkt übereinstimmen (pI, 5,6 ± 0,2, Abb. 4b). Die KB76-Protease von Br. Andere Forscher berichteten, dass Otitidis18 und die hornhautschädigende Protease eines P. aeruginosa-Stammes4 ähnliche pIs aufweisen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die pH-Stabilität der UcB5-Protease 60 Minuten lang zwischen 8 und 11 lag (Abb. 4a), ähnlich der Protease von Aeromonas veronii PG0128, im Gegensatz zur ZuhP13-Protease17 und der ME4-Protease von P. aeruginosa24, die bei pH 6 stabil waren –9 für 60 Min.

Gegenüber den untersuchten chromogenen Substraten zeigte das Enzym unterschiedliche Grade an amidolytischer Aktivität (Tabelle 2). Das Standard-Proteasesubstrat für Chymotrypsin- und Subtilisin-Proteasen, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, war das am weitesten vom UcB5 abgebaute Substrat und zeigte eine amidolytische Aktivität von 28,9 µmol min−1 L−1. Darüber hinaus baute UcB5 das chromogene Substrat D-Val-Leu-Lys-pNA ab, das das Standardsubstrat von Plasminproteasen ist, und D-Phe-Pip-Arg-pNA, das das Substrat von Thrombinproteasen ist. Allerdings zeigte das Enzym die geringste Aktivität gegen D-Val-Leu-Arg-pNA, das chromogene Substrat der Kallikrein-Proteasetypen. Aus diesen Erkenntnissen können wir schließen, dass UcB5 Subtilisin oder Chymotrypsin ähnelt, da es Lys-Peptid-Bindungen leichter hydrolysiert als Arg-Peptid-Bindungen. Interessanterweise greift Subtilisin UcB5 D-Phe-Pip-Arg-pNA wirksamer an als D-Val-Leu-Arg-pNA, wie die Subtilisin-FS33-Protease29, was es von anderen Subtilisinen unterscheidet.

Die kinetischen Werte für UcB5 gegenüber dem Substrat N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA waren; Km von 0,16 mM und Kcat/Km von 301 mM−1 S−1. Bezüglich anderer Subtilisine zeigte ZuhP13 aus P. aeruginosa eine katalytische Wirksamkeit von 4,62 × 107 M−1 S−1 mit einem Kcat von 1,27 S−117. Die katalytische Wirksamkeit von ZapA aus Proteus mirabilis N17-12 gegen Phe-Ser betrug 291 mM−1 S−1, Km betrug 13,6 µM und Kcat betrug 3,96 S−1, während die katalytische Wirksamkeit gegen Phe-Leu 13 mM−1 betrug S−1, Km betrug 2,3 µM und Kcat betrug 0,03 S−130.

Bei der Untersuchung der Wirkung von Kationen auf die amidolytische Aktivität war keines der Kationen ein Enzymaktivator. Bei der Betrachtung der Wirkungen von Proteasereagenzien wurde festgestellt, dass 2,2'-Bipyridin, DTT, o-Phenanthrolin, β-Mercaptoethanol und die beiden Metalloproteaseinhibitoren (EDTA und EGTA) keinen Einfluss auf die Aktivität von UcB5 hatten (Tabelle 2). ). Darüber hinaus hatten die Mercaptidbildner (PHMB und EAM) keinen Einfluss auf die proteolytische Aktivität. Dementsprechend schlagen wir vor, dass sich Tryptophan- (Indol) und Serin- (Hydroxy-)Gruppen am oder in der Nähe des aktiven Zentrums von UcB5 befinden. In Kombination mit unseren Erkenntnissen schlagen wir vor, dass UcB5 zu den Serinproteasen gehört, die der virulenten E. coli-espP-Protease ähneln31. In der Literatur stellten wir fest, dass virulente Serinproteasen im Vergleich zu virulenten Metalloproteasen selten sind. Letzterer Typ wurde in den Extrakten von Y. ruckeri19, P. mirabilis N17-1230 und fast allen Stämmen von P. aeruginosa24,25 entdeckt.

Die relative Aktivität von UcB5 gegen Fibrin, Gelatine, Mucin, Hämoglobin, Fibrinogen, Elastin, Kollagen, IgG und Serumalbumin betrug 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5, 0,0 bzw. 12,7 %. Die Unproteolyse des Immunglobulins Typ G könnte für die Produktion chimärer Proteine aus UcB5 und IgG zur gezielten Bekämpfung spezifischer unerwünschter Zellen vielversprechend sein. Das anschließende Experiment, bei dem die gerinnungshemmenden Eigenschaften des Enzyms bewertet wurden, bestätigte die proteolytische Wirkung gegen Plasmaproteine weiter (Ergänzungstabelle S1). In Gegenwart von UcB5 verlängerte sich die Gerinnungszeit des Blutes auf 81 s, was dem 3,5-fachen der Gerinnungszeit ohne Enzym entspricht. Die Fähigkeit von UcB5, Fibrin und Fibrinogen zu zerstören, stützt die Annahme, dass mikrobielle Proteasen die bakterielle Translokation im Körper erleichtern. Daher befürworten wir den Einsatz eines geeigneten Proteaseinhibitors in Kombination mit Antibiotika und nicht nur Antibiotika allein zur Behandlung bakterieller Infektionen im menschlichen Körper32.

Während des in der Ergänzungstabelle S1 beschriebenen In-vitro-Experimentes zeigte UcB5 einen Zelltod von 63,8 % der kultivierten HT29-Zelllinie. Außerdem löste es einen 3,9-fachen Anstieg der Hämolyse roter Blutkörperchen aus. Infolgedessen scheint der Zerfall der Zelle und der Erythrozytenmembran eine Phase in der Wirkungsweise von UcB5 zu sein. Als dies geschah, begann das Enzym mit Hämoglobin und anderen wichtigen internen Proteinen zu reagieren. Diese Eigenschaft von UcB5 könnte die Ursache für Blutungen sein, die in den inneren Hohlräumen des Brustkorbs und des Abdomens der sezierten Tiere beobachtet wurden. Die dargestellten hämolytischen und hämorrhagischen Aktivitäten von UcB5 stimmen mit der Protease A von V. parahemolyticus Nr. überein. 9323 und ZuhP13-Protease von P. aeruginosa17.

Bei der Injektion von UcB5 in Mäuse kam es zu einer Bläschenbildung (V) innerhalb der Hepatozyten und die Kernmembranen (nm) wurden aufgrund der Ansammlung von Heterochromatin (Hc) deformiert. Darüber hinaus zeigte die TEM, dass die Zellmembran und das raue endoplasmatische Retikulum (ER) der Hepatozyten vollständig verschwunden waren (Abb. 5). Die durch UcB5 verursachte zelluläre und nukleare Lyse kann auf Nekrose und nicht auf Apoptose zurückzuführen sein, da keine Beeinträchtigung der mitochondrialen Konfigurationen (M) vorliegt. Bezüglich der genannten pathologischen Proteasen wird Pseudoalteromonas sp. N10- und V. vulnificus-Proteasen führten zu einer Beeinträchtigung der Muskelproteine bzw. zeigten tiefe Wundnekrose33. Fische erlitten durch die Y. ruckeri-Protease erhebliche Zellschäden19. Andererseits haben Forscher gezeigt, dass Proteasen von Streptokokken sowohl nekrotisierende Fasziitis als auch zelluläre Apoptose von Wirtsgeweben auslösten34.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Diethylaminoethyl

Dimethylsulfoxid

1,4-Dithiothreitol

Aminobenzamidinethylacetimidat

Ethylendiamintetraessigsäure

Ethylenglykotetraessigsäure

Immunglobulin der Klasse G

Luria – Bauernbrühe

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Reagenz

Polyhexamethylenbiguanid

Isoelektrischer Punkt

Phenylmethylsulfonylfluorid

P-Nitroanilin

Soja-Trypsin-Inhibitor

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Salmonellen-Shigella-Agar

Transmissionselektronenmikroskop

Tosyl-l-lysin-chlormethylketon

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Die Autoren danken dem Stellvertreter für Forschung und Innovation des Bildungsministeriums in Saudi-Arabien für die Finanzierung dieser Forschungsarbeit unter der Projektnummer IF-2020-028-BASRC an der Imam Abdulrahman bin Faisal University (IAU)/Zentrum für Grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung (BASRC).

Department of Biology, College of Science, Imam Abdulrahman Bin Faisal University (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Saudi-Arabien

Essam Kotb, Haifa A. Alqahtani, Hussah A. Al-shwyeh, Sakina M. Algarudi und Hanan Almahasheer

Zentrum für Grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung, Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Postfach 1982, Dammam, 31441, Saudi-Arabien

Essam Kotb, Hussah A. Al-shwyeh und Sakina M. Algarudi

Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, 33516, Ägypten

Baher A. El-Nogoumy

Abteilung für Statistik, Fakultät für Handel, Al-Azhar-Universität (Mädchenabteilung), Postfach 11751, Kairo, Ägypten

Asmaa A. Ahmed

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EK führte das Studiendesign und die enzymologischen Studien durch. BAE führte die Bakteriencharakterisierung und die In-vivo-Studie durch. HAA half bei der In-vivo-Studie. AAA führte die statistische Analyse und die Softwarearbeit durch, einschließlich der Ermittlung der Daten. HAAl. half bei den enzymologischen Studien. SMA half bei der Probenentnahme und Softwarearbeit. HA half bei der Umweltprobenahme und der Bearbeitung des Manuskripts. Alle Autoren haben beim Entwurf des Manuskripts mitgeholfen und die endgültige Form genehmigt.

Korrespondenz mit Essam Kotb.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kotb, E., El-Nogoumy, BA, Alqahtani, HA et al. Eine mutmaßliche zytotoxische Serinprotease aus Salmonella typhimurium UcB5, gewonnen aus unzureichend gegartem Burger. Sci Rep 13, 3926 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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Eingegangen: 19. September 2022

Angenommen: 10. Februar 2023

Veröffentlicht: 09. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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