Rekonstitution der Monoterpen-Indol-Alkaloid-Biosynthese in genomtechnisch veränderter Nicotiana benthamiana

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 949 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Monoterpen-Indol-Alkaloide (MIAs) sind eine vielfältige Klasse pflanzlicher Naturstoffe, die eine Reihe medizinisch wichtiger Verbindungen umfassen. Unser Ziel war es, den Weg für Strictosidin, ein wichtiges Zwischenprodukt aller MIAs, aus dem zentralen Stoffwechsel in Nicotiana benthamiana wiederherzustellen. Ein Nachteil dieses Wirts besteht darin, dass sein reichhaltiger Hintergrundstoffwechsel zur Derivatisierung einiger heterolog produzierter Moleküle führt. Hier verwenden wir eine transkriptomische Analyse, um Glykosyltransferasen zu identifizieren, die als Reaktion auf biosynthetische Zwischenprodukte hochreguliert werden, und Pflanzenlinien mit gezielten Mutationen in den für sie kodierenden Genen zu produzieren. Die Expression des frühen MIA-Signalwegs in diesen Linien führt zu einem günstigeren Produktprofil. Die Strictosidin-Biosynthese wurde erfolgreich wiederhergestellt, wobei die besten Ausbeuten durch die Koexpression von 14 Enzymen erzielt wurden, von denen ein wichtiges latexproteinähnliches Enzym (MLPL) aus Nepeta (Katzenminze) für die Verbesserung des Flusses durch den Iridoidweg entscheidend ist. Die Entfernung endogener Glykosyltransferasen hat keinen Einfluss auf die Ausbeuten von Strictosidin, was unterstreicht, dass der metabolische Fluss der Enzyme des Stoffwechselwegs zu einem stabilen biosynthetischen Zwischenprodukt die Notwendigkeit minimiert, den endogenen Stoffwechsel des Wirts zu verändern. Die Produktion von Strictosidin in Planta erweitert die Palette der MIA-Produkte, die für die biologische Synthese geeignet sind.

Die Anwendung von Ansätzen der synthetischen Biologie zur Entwicklung von Pflanzensystemen hat Fortschritte bei der Kontrolle und Expression von Biosynthesewegen ermöglicht und es Pflanzen ermöglicht, als alternative biochemische Produktionschassis zu dienen1,2. Ein Verwandter des Tabaks, N. benthamiana3,4, hat sich als bevorzugte Art für die pflanzliche Produktion von pharmazeutischen Proteinen5 und die Wiederherstellung von Stoffwechselwegen2 herausgestellt. Zu den Erfolgen zählen die Produktion von Triterpenoiden im Gramm-Maßstab6 und die Produktion von Etoposiden im Milligramm-Maßstab7. Allerdings wurde in mehreren Studien über die Anhäufung unbeabsichtigter Nebenprodukte berichtet, die vermutlich durch die Off-Target-Aktivitäten endogener N.-benthamiana-Enzyme wie Oxidasen und Glykosyltransferasen entstehen8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. Obwohl die Aktivität endogener Enzyme in einigen Studien zur Herstellung neuer Moleküle9 oder zum Ausgleich des Fehlens eines bekannten Enzyms19 genutzt wurde, ist die Derivatisierung von Molekülen größtenteils ein Nachteil, da sie die potenzielle Reinheit und Ausbeute der Zielverbindung verringert.

Monoterpen-Indol-Alkaloide (MIAs) sind eine große Gruppe pflanzlicher Naturstoffe, von denen über 3000 identifiziert wurden20. Zu dieser Molekülklasse gehören viele medizinisch wertvolle Verbindungen, die zur Behandlung von Sucht, Herzerkrankungen, Demenz, Schmerzen, Krebs, Malaria und Diabetes eingesetzt werden. Die am besten charakterisierte MIA-produzierende Pflanze ist Catharanthus roseus (Madagaskar-Immergrün), die über 130 MIAs produziert, darunter das bioaktive Vinblastin und Vincristin, die als Chemotherapien eingesetzt werden. Allerdings sind diese wertvollen Moleküle in C. roseus in geringen Konzentrationen vorhanden (0,0005 % Trockengewicht)21, was ihre Verfügbarkeit einschränkt. Eine Massenkultivierung von C.-roseus-Zellen ist möglich, es wurde jedoch noch nicht über eine Zelllinie berichtet, die diese Antikrebsmoleküle dauerhaft produziert22. Obwohl über Methoden zur vorübergehenden Expression23 und stabilen genetischen Transformation24 von C. roseus-Pflanzen berichtet wurde, bleibt die genetische Veränderung der nativen Wirtspflanze zur Steigerung der Erträge dieser Verbindungen technisch schwierig. Darüber hinaus bedeutet die strukturelle Komplexität vieler MIAs, dass die chemische Synthese oft eine Herausforderung darstellt25,26. Folglich sind alternative Produktionswege wünschenswert und die jüngste Entdeckung fehlender Schritte im Vinblastin-Weg27,28 macht die Rekonstruktion des Wegs in einem heterologen Wirt zu einer zunehmend attraktiven Option.

Um die Produktion therapeutisch nützlicher Mengen an MIAs zu erreichen, ist eine Wegetechnik erforderlich, um den Stoffwechselfluss durch die frühen Teile des Weges zu maximieren. Strictosidin ist das letzte gemeinsame biosynthetische Zwischenprodukt, von dem alle über 3000 bekannten MIAs abgeleitet sind. Die Wiederherstellung des etwa 11-stufigen Biosynthesewegs in Mikroorganismen kann eine umfassende Abstimmung der Enzymexpressionsbedingungen und Stammoptimierung29 erfordern. Beispielsweise hat die schlechte Expression von Geraniol-8-hydroxylase (G8H) die Striktosidinproduktion in Hefe behindert30. Die Erzielung nützlicher Ausbeuten von Molekülen wie Vinblastin, die die Expression weiterer 16+ Enzyme über Strictosidin hinaus erfordern würden, erfordert wahrscheinlich erhebliche technische Eingriffe, obwohl Hefe kürzlich so manipuliert wurde, dass sie Ajmalicin über die genomische Integration von 29 Expressionskassetten produziert, was dies beweist Potenzial für die heterologe Rekonstruktion der Biosynthesewege pflanzlicher Naturstoffe31.

Während Hefe nach wie vor ein vielversprechender Wirt für die heterologe Expression von Stoffwechselwegen ist, erfordern pflanzliche Proteine ​​häufig weniger Optimierung und Engineering für eine erfolgreiche Expression in einem Pflanzenwirt. Die Expression in N. benthamiana wurde von Miettinen und Mitarbeitern genutzt, um den Iridoid-Weg von C. roseus wiederherzustellen, was die Aufklärung der verbleibenden vier fehlenden Schritte des Weges ermöglichte26. Sie stießen jedoch auf halbem Weg durch den 13-stufigen Weg, der eine Rekonstitution in zwei Phasen erforderte, auf einen metabolischen Engpass, wobei der letzte Teil die Bereitstellung eines Zwischensubstrats (Iridotrial) erforderte, um Striktosidin zu erhalten27. Darüber hinaus wirkte der reichhaltige endogene Stoffwechsel von N. benthamiana auf die frühen, hydrophoben Zwischenprodukte der Strictosidin-Biosynthese ein, um eine Vielzahl derivatisierter Dead-End-Produkte zu produzieren.

Hier haben wir erfolgreich die De-novo-Produktion von Strictosidin in N. benthamiana entwickelt. Wir identifizieren endogene Glykosyltransferasen, die Zwischenprodukte des frühen Signalwegs derivatisieren, und zeigen, dass sich in Pflanzenlinien mit Funktionsverlustmutationen in den Genen, die diese Enzyme kodieren, weniger Derivate ansammeln. Wir nutzen zusätzliche Gene, die die Produktion von Nepetalactol steigern und die Produktion hoher Mengen an Strictosidin aus dem zentralen Stoffwechsel von N. benthamiana ermöglichen, ohne dass eine Ergänzung durch Metabolitenvorläufer oder -zwischenprodukte erforderlich ist. Insgesamt zeigt diese Studie das Potenzial von N. benthamiana als Bioproduktions-Chassis für kleine Moleküle.

Strictosidin wird vom Terpenoid Secologanin abgeleitet. Secologanin gehört zur Iridoid-Klasse der Monoterpene, die durch Oxidation, reduktive Cyclisierung und wesentliche Derivatisierung von Geraniol entstehen. Nach der Bildung durchläuft Secologanin eine Kondensation und Zyklisierung mit Tryptamin, um Strictosidin zu bilden. Frühere Studien, die auf die heterologe Expression niedermolekularer Terpenoid-Biosynthesewege in N. benthamiana abzielten, berichteten über die Akkumulation derivatisierter Biosynthese-Zwischenprodukte29. Um die Derivatisierung in den frühen Schritten des Iridoid-Signalwegs zu untersuchen, exprimierten wir vorübergehend die Enzyme des frühen Strictosidin-Signalwegs, indem wir N. benthamiana gemeinsam mit A. tumefaciens-Stämmen infiltrierten, die Plasmide enthielten, die für Schritte des Signalwegs bis zu cis-trans-Nepetalactol kodieren (Abb. 1). Um den Pool an Geraniolpyrophosphat (GPP)-Substrat aus dem plastidialen 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat/1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (MEP/DOXP)-Weg zu erweitern, haben wir ein bifunktionelles Geranyl/ Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase aus Picea abies (PaGPPS) und 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (DXS) aus C. roseus (CrDXS), die beide auf das Plastid abzielen. Um Geraniol zu produzieren, wurden diese mit der Geraniol-Synthase aus C. roseus (CrGES) koexprimiert, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die heterologe Produktion von Geraniol in Pflanzen ermöglicht32. Anschließend fügten wir die ersten drei dedizierten Strictosidin-Wegschritte hinzu: Geraniol-8-Oxidase (CrG8H), 8-Hydroxygeraniol-Oxidoreduktase (CrGOR) und Iridoid-Synthase (CrISY), um cis-trans-Nepetalactol zu produzieren, und führten eine hochauflösende Massenspektrometrie von vorübergehend infiziertem N durch. Benthamiana geht, um die enzymatischen Produkte zu identifizieren. Wie von Dong und Mitarbeitern32 berichtet, fanden wir heraus, dass die vorübergehende Expression von CrDXS, PaGPPS und CrGES eine Reihe nichtflüchtiger glykosylierter und oxidierter Derivate von Geraniol erzeugt (Abb. 1 und Ergänzungstabelle 1). Durch die Hinzufügung späterer Stoffwechselschritte bis hin zu cis-trans-Nepetalactol wurde das Profil der derivatisierten Produkte weiter verändert. Im Allgemeinen sammelten sich weniger Derivate an, je mehr Schritte des Stoffwechselwegs hinzugefügt wurden, was darauf hindeutet, dass die starke, konstitutive Expression es den Stoffwechselwegenzymen ermöglichte, endogene Substrate zu übertreffen (Abb. 1).

Eine übliche Modifikation war die Zugabe von Pentose- und Hexosezuckern, z. B. Peak 1, Hexosylhydroxygeraniol [M + HCOOH-H], 3,84 min, m/z 377,1817; Peak 2, Hexosylhydroxycitronellal [M + HCOOH-H], 4,12 min, m/z 379,1974; Peak 3, Trihexosylgeransäure [M + HCOOH-H], 4,35 min, m/z 699,2703); Peak 4, Pentosylhexosylgeraniol [M + HCOOH-H], 5,32 min, m/z 493,2288; Peak 5, Acetyldihexosylgeraniol [MH], 5,454 min, m/z 519,2445; DXS, 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase; GPPS, Geranyldiphosphat-Synthase; GES, Geraniol-Synthase; G8H, Geraniol-8-Oxidase; GOR, 8-Hydroxygeraniol-Oxidoreduktase; ISY, Iridoidsynthase.

Eines der gemeinsamen Merkmale der Derivatisierung war die Zugabe von Pentose- und Hexosezuckern. Die Enzyme, die in erster Linie für die Glykosylierung pflanzlicher Naturstoffe, einschließlich Monoterpene, verantwortlich sind, gehören zur Glykosyltransferase-Familie 133. Wir stellten die Hypothese auf, dass viele dieser UGTs wahrscheinlich an der Biosynthese endogener Sekundärmetaboliten beteiligt sind, die beispielsweise zur Verteidigung eingesetzt werden. Alternativ können diese UGTs an der Entgiftung verschiedener Metaboliten beteiligt sein. Wir gingen daher davon aus, dass die Einführung von Mutationen mit Funktionsverlust in die für sie kodierenden Gene wahrscheinlich keine wesentlichen Auswirkungen auf die Entwicklung von Pflanzen haben würde, die in den kontrollierten Umgebungen für die Agroinfiltration angebaut werden. Während jedoch eine große Anzahl von UGTs leicht identifiziert werden kann, indem die Genome aller Gefäßpflanzen nach geeigneten Homologen durchsucht werden, ist die Vorhersage der Substratspezifitäten und die Identifizierung einzelner Gene, die für die Modifikation spezifischer Metaboliten verantwortlich sind, eine Herausforderung34.

Um zu untersuchen, ob Änderungen in der Genexpression mit den beobachteten chemischen Modifikationen korrelieren, führten wir eine Transkriptomanalyse von Blattproben durch, die mit dem Iridoid-Signalweg infiltriert waren. Da zuvor eine erhebliche Transkriptionsreaktion auf Agroinfiltration beobachtet wurde35, verglichen wir Veränderungen der Expression sowohl mit nicht infiltrierten Kontrollen als auch mit Kontrollpflanzen, die mit einem konstitutiv exprimierten grün fluoreszierenden Protein (GFP) infiltriert waren (siehe Methoden). Wir beobachteten, dass die Expression einiger UGTs als Reaktion auf die Infiltration zunahm, während andere spezifisch als Reaktion auf die Expression des Weges zu Geraniol oder Nepetalactol zunahmen (Ergänzungstabelle 2). Wir führten auch eine phylogenetische Analyse aller UGTs der Familie 1 durch, die im Blatttranskriptom von N. benthamiana identifiziert wurden (siehe Methoden), und untersuchten ihre Beziehung zu denen, die in Arabidopsis thaliana gefunden wurden, und zu zuvor charakterisierten Pflanzen-UGTs, von denen bekannt ist, dass sie auf Geraniol- und Nepetalactol-Substraten aktiv sind (Abb . 2 und ergänzende Abb. 1).

Die Gruppen AP werden gemäß der von Caputi et al. verwendeten Nomenklatur kommentiert. 201233. Markierte Taxa weisen auf Enzyme hin, in die anschließend Cas9-vermittelte gezielte Mutationen eingeführt wurden. Gefüllte graue Kreise an Knoten zeigen Bootstrap-Unterstützungen >95 an. Der Maßstabsbalken stellt die Anzahl der Ersetzungen pro Standort dar. Ein Baum mit allen Taxa- und Bootstrap-Werten ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Möglichkeit zur Verbesserung des N.-benthamiana-Chassis darin bestünde, diese endogenen UGTs durch die Einführung von Mutationen in die für sie kodierenden Gene zu entfernen. Mithilfe der Expressionsprofile und der vorhergesagten Substratselektivität wählten wir genetische Ziele für die Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese aus. Anschließend konstruierten wir 8 Plasmide, die auf insgesamt 25 UGTs abzielten (Tabelle 1). Wir haben zunächst drei binäre Vektoren für die stabile Transformation von Wildtyp-N. benthamiana-Pflanzen entworfen (pEPQDPKN0720, pEPQDPKN0724, pEPQDPKN0361) (Ergänzende Abbildungen 2–4). Diese Konstrukte kodierten sgRNAs, die auf Gene abzielten, die für UGTs in den Gruppen D, E und G kodieren, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie auf Geraniol aktiv sind36,37 sowie auf nicht charakterisierte UGTs aus denselben Gruppen mit der Logik, dass sie auf demselben Substrat aktiv sein könnten (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 3). Da die UGTs, auf die jedes Konstrukt abzielte, eng miteinander verwandt waren, konnten einige sgRNAs auf mehr als ein Gen abzielen. Folglich kodierte jedes Konstrukt sechs sgRNAs, die auf das erste oder zweite Exon von entweder vier UGTs der Gruppe D, fünf UGTs der Gruppe E oder drei UGTs der Gruppe G abzielten (Tabelle 1 und ergänzende Abbildungen 2–4). Diese Konstrukte wurden an Wildtyp-Pflanzen verabreicht und die Genotypen regenerierter transgener (T0) Pflanzen wurden bestimmt. Wir haben Linien verworfen, bei denen der Genotyp unklar war oder auf einen möglichen genetischen Chimärismus hinwies, und Linien mit homozygoten, heterozygoten oder biallelischen Mutationen an den Zielorten ausgewählt. Die Genotypen wurden in T1-Pflanzen zusammen mit der Anwesenheit oder Abwesenheit der T-DNA bestätigt. Alle 18 sgRNAs führten Mutationen in mindestens einer T0-Pflanze ein. Bemerkenswerterweise konnten wir keine Pflanzen mit Frameshift-Mutationen sowohl in NbUGT72B58 als auch in NbUGT72B35 gewinnen. Wir konnten jedoch Linien mit Mutationen in jedem dieser Gene in Kombination mit anderen UGTs der Gruppe E gewinnen (Tabelle 1). Wir haben sechs T1-Pflanzen mit Mutationen in unterschiedlichen Kombinationen von 12 einzelnen Genen ausgewählt (Tabelle 1). Alle Linien waren morphologisch normal, zeigten keine offensichtlichen Veränderungen in Wachstum und Entwicklung und reiften gleichzeitig mit den Kontrolllinien.

Wir haben außerdem fünf TMV-basierte virale Vektoren entworfen und gebaut, die mobile sgRNAs codieren, und zwar unter Verwendung der zuvor von Ellison und Kollegen beschriebenen Methoden38. Vier Vektoren enthielten mobile sgRNAs, die auf UGTs abzielten, die entweder nach der Infiltration stark hochreguliert waren (pEPQDKN0777), als Reaktion auf die Expression des Geraniol-Signalwegs (pEPQDKN0778) oder des Nepetalactol-Signalwegs stark hochreguliert waren (pEPQDKN0779) oder nach der Expression des Nepetalactol-Signalwegs hohe normalisierte Zahlen aufwiesen ( pEPQDKN0780) (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 5 und ergänzende Tabelle 2). Ein endgültiger Vektor kodierte drei mobile sgRNAs, die auf vier UGTs abzielten, von denen bekannt ist, dass sie auf Geraniol37 (pEPQDKN0781) aktiv sind (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 5 und ergänzende Tabelle 3). Diese Vektoren wurden in transgene Pflanzen infiltriert, die konstitutiv Cas9 exprimierten. Nachkommensamen (als E1 bezeichnet) wurden aus Schoten gesammelt, die sich an Stämmen bildeten, in denen an den Zielstellen Mutationen nachgewiesen wurden (siehe Methoden). Die Genotypen der E1-Pflanzen wurden analysiert, wobei wiederum Linien mit homozygoten, heterozygoten oder biallelischen Mutationen an Zielorten ausgewählt wurden. Insgesamt war die mobile sgRNA-Methode weniger effizient, da acht von fünfzehn mobilen sgRNAs Mutationen an ihrem Ziel einführten. Dies führte zur Auswahl von fünf E1-Linien mit jeweils Mutationen in einem, zwei oder drei Ziel-UGTs (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 5). Wie oben gab es keine Veränderungen im Wachstum oder in der Entwicklung.

Um zu untersuchen, ob die Einführung von Mutationen in UGTs das Vorhandensein von Geraniol-Derivaten verringern würde, wurden mutierte Pflanzen, deren Genotypen aller Zielorte bestätigt worden waren, mit Stämmen von Agrobacterium infiltriert, die für Enzyme des Signalwegs kodieren, um entweder Geraniol oder cis-trans-Nepetalactol zu produzieren. Die Proben wurden wie zuvor besprochen durch UHPLC/MS auf Derivate analysiert und das Stoffwechselprofil mit Elternlinien (Wildtyp- und Cas9-transgenen Linien) und den Nachkommen einer nicht-transgenen, nicht mutierten Kontrolllinie, die in Gewebekultur regeneriert und gezüchtet wurde, verglichen unter identischen Bedingungen.

Pflanzen mit Mutationen im UGT der Gruppe A, NbUGT94E7, akkumulierten keine Trihexosylgeransäure (m/z 699,2713, [M + HCOOH-H]) nach der Expression von Stoffwechselenzymen zur Produktion von Geraniol oder Nepetalactol (Abb. 3, Ergänzende Daten 1). , Ergänzende Abbildungen 6 und 7). Das Vorhandensein von Acetyldihexosylgeraniol (m/z 519,2445, [MH]) wurde auch in Proben eliminiert, in denen Enzyme des Stoffwechselwegs zur Produktion von Nepetalactol exprimiert wurden. Darüber hinaus akkumulierten drei Linien mit Mutationen in der Gruppe G NbUGT85 A73 in Kombination mit entweder NbUGT72AY1 (Gruppe E) oder NbUGT85A74 und NbUGT85A104 (Gruppe G) weniger oder kein Hexosylhydroxygeraniol (m/z 377,1817, [M + HCOOH-H]). , Hexosylhydroxycitronellal (m/z 379,1974, [M + HCOOH-H]), Pentosylhexosylgeraniol (m/z 493,2288, [M + HCOOH-H]) oder Acetyldihexosylgeraniol (m/z 519,2445, [MH]) ( Abb. 3, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Abbildungen 6 und 7). Interessanterweise fehlten diese Peaks nur in Proben, in denen Enzyme des Stoffwechselwegs zur Produktion von Nepetalactol exprimiert wurden.

Die zugeordneten Identitäten der Peaks 1–5 sind in Abb. 1 dargestellt. Sternchen zeigen an, dass bereits über eine Aktivität auf Geraniol berichtet wurde. Werte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler von n = 3 biologischen Replikaten dar. Beim paarweisen Vergleich aller mutierten Linien mit allen drei Kontrolllinien (graue Balken) unterscheiden sich die Mittelwerte, gefolgt von einem gemeinsamen griechischen Buchstaben (α,β,γ,δ), durch eine einfaktorielle ANOVA mit Post-hoc-Tukey-HSD nicht signifikant auf dem Signifikanzniveau von 5 %. Parzellen ohne griechische Buchstabenwerte weisen keine experimentellen Linien mit signifikanten Unterschieden zu den drei Kontrolllinien auf.

Anschließend konzentrierten wir uns auf die Erweiterung des Iridoidwegs mit dem Ziel, den Weg bis zum zentralen Strictosidin-Zwischenprodukt wiederherzustellen. Bei einem zuvor gemeldeten Versuch kam es zu einem metabolischen Engpass, der die Infiltration von Iridotrial erforderte, um Strictosidin zu erhalten38. Der Biosyntheseweg zur Produktion von cis-trans-Nepetalacton in der Gattung Nepeta ähnelt dem Secoiridoidweg von C. roseus bis zur stereoselektiven Reduktion von 8-Oxogeranial zu einem Enol-Zwischenprodukt durch die NADPH-abhängige Iridoidsynthase (ISY)39. Kürzlich wurde gezeigt, dass ISY in Nepeta in Kombination mit entweder Nepetalactol-verwandten kurzkettigen Dehydrogenase-Reduktasen (NEPS) oder einem wichtigen Latexprotein-ähnlichen Enzym (MLPL) arbeitet, um die Stereoselektivität des Ringschlusses zu steuern40,41. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Zugabe des MLPL aus Nepeta mussinii (auch bekannt als Nepeta racemosa), das spezifisch für die in Strictosidin gefundene Stereochemie ist, den Fluss durch den Signalweg in N. benthamiana erhöhen würde. Jüngste Versuche zur Rekonstitution in Hefe-31 und zellfreien Systemen42 haben auch gezeigt, dass dieses Enzym die Ausbeute erheblich steigert.

Die Infiltration aller Stoffwechselwegenzyme zur Produktion von 7-DLA ohne MLPL führte nicht zu einem Peak für 7-DLA (erwartetes m/z 359,1349) oder acyliertes 7-DLA (erwartetes m/z 401,1447), was mit früheren Berichten übereinstimmt39 (Abb. 4). . Der Einschluss von MLPL führte jedoch zu einem klaren Peak von m/z 359,1342, der der Retentionszeit des 7-DLA-Standards entspricht. Der Ausschluss von 7-Desoxylogansäure-Glucosyltransferase (7-DLGT) führt zu einem Peak mit demselben m/z, der jedoch nicht mit der Retentionszeit von 7-DLA übereinstimmt. Es ist möglich, dass endogene UGTs 7-Desoxylogansäure zur Herstellung eines Glucoseesters verwenden können. Wie beim frühen Signalweg beobachtet, kann eine starke, konstitutive Expression von Signalweg-Genen (in diesem Fall 7-DLGT) native Enzyme übertreffen, was dazu führt, dass dieser mutmaßliche Glucoseester-Peak in den Spektren des vollständigen 7-DLA-Signalwegs fehlt.

Die vorübergehende Expression aller Enzyme des Signalwegs plus MLPL erzeugt einen Peak von 359,1342 m/z, der der Masse und Retentionszeit eines 7-Desoxylogansäure-Standards (7-DLA) entspricht. Der wiederhergestellte Signalweg ohne DLGT erzeugt ebenfalls einen Peak bei 359,1343 m/z, jedoch mit einer anderen Retentionszeit, was wahrscheinlich auf endogene Glykosyltransferasen von N. benthamiana zurückzuführen ist, die den Glucoseester von 7-Desoxylogansäure produzieren. DXS, 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase; GPPS, Geranyldiphosphat-Synthase; GES, Geraniol-Synthase; G8H, Geraniol-8-Oxidase; GOR, 8-Hydroxygeraniol-Oxidoreduktase; ISY, Iridoidsynthase; MLPL, Hauptlatexprotein-ähnlich; IO, Iridoidoxidase; 7-DLGT, 7-Desoxylogansäure-Glucosyltransferase.

Aufbauend auf den experimentellen Bedingungen, unter denen 7-DLA erfolgreich hergestellt wurde, fügten wir nacheinander die verbleibenden fünf Stoffwechselwegenzyme hinzu und maßen die Stoffwechselwegzwischenprodukte nach der sequentiellen Zugabe jedes Gens (Abb. 5a, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Abbildungen 8–12). Die gleichzeitige Infiltration von Stämmen, die Enzyme für den gesamten Signalweg exprimieren, erzeugt einen deutlichen Peak bei 531 m/z, der dem Strictosidin-Standard entspricht (Abb. 5b, c, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Abb. 11). Diese Signalwegkonfiguration produziert 4,29 ± 2,00 µM Strictosidin, was 0,23 ± 0,11 mg Strictosidin/g Trockengewicht Blattgewebe (0,023 % DW) entspricht. Das einzige wichtige biosynthetische Zwischenprodukt, dessen Akkumulation beobachtet wurde, war Loganin, was darauf hindeutet, dass die Secologanin-Synthase ein Engpassschritt ist. Dies steht im Gegensatz zu früheren Daten, die darauf hindeuten, dass Logansäure-O-Methyltransferase (LAMT), die eine niedrige Substrataffinität (Km = 12,5–14,8 mM)43,44 aufweist, ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt in den späten Stadien des Secoiridoid-Signalwegs sein könnte. Zusätzlich zu Strictosidin entsteht bei der vorübergehenden Expression des gesamten Stoffwechselwegs auch eine geringere Menge einer Verbindung (Abb. 5c, ergänzende Abb. 11) mit einer Massenverschiebung von 86 Da gegenüber Strictosidin, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei möglicherweise um ein malonyliertes Derivat des produzierten Strictosidins handelt durch endogene N. benthamiana-Acyltransferasen. Die vorübergehende Expression des Strictosidin-Signalwegs ohne GPPS und MLPL (Abb. 5b, Zusatzdaten 1) bestätigt die positive Wirkung dieser Enzyme auf die Strictosidin-Ausbeute. Die Zugabe von MLPL steigerte die Strictosidin-Produktion um das >60-fache, während die Ergänzung von GPPS die Ausbeute um das ~5-fache steigerte. Die DXS-Supplementierung veränderte die Menge des produzierten Striktosidins nicht (Abb. 1).

a Quantifizierung der Zwischenprodukte und des Endprodukts Strictosidin mittels UPLC/MS-Analyse. b Das Fehlen von MLPL reduziert die Strictosidin-Produktion um das >60-fache, während die Ergänzung mit GPPS die Ausbeute um das ~5-fache verbessert. c das Gesamtionenchromatogramm von Blattgewebe, das mit dem gesamten Weg zu Strictosidin (einschließlich DXS, GPPS und MLPL) infiltriert ist. Der Peak bei 4,09 min Retentionszeit im Gesamtionenchromatogramm (TIC) und im extrahierten Ionenchromatogramm (EIC) bei 531,2336 m/z entspricht einem Strictosidin-Standard. ND, nicht erkannt; 7-DLH, 7-Desoxylogansäurehydroxylase; LAMT, Logansäure-O-Methyltransferase; SLS, Secologanin-Synthase; TDC, Tryptophan-Decarboxylase; STR, Strictosidin-Synthase. Werte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler von n = 3 oder n = 6 biologischen Replikaten (unabhängige Blattproben) dar.

Wir infiltrierten auch den gesamten Signalweg in die zuvor identifizierten Linien mit Mutationen in UGT94E7 (Gruppe A) oder NbUGT85A73 (Gruppe G), die jeweils die Anhäufung weniger früher Iridoid-Derivate gezeigt hatten. Wir haben jedoch keine Veränderungen in der Ausbeute an Strictosidin oder Strictosidin-Nebenprodukten beobachtet (ergänzende Abbildung 13).

Um die Auswirkung der Lokalisierung von Chloroplasten und zytosolischen Enzymen auf die Ausbeuten der 7-DLA- und Strictosidin-Produktion zu vergleichen, haben wir jedem Enzym ein Transitpeptid hinzugefügt (oder im Fall von GPPS/GES entfernt) (Abb. 6, Ergänzende Daten 1). Um den Fluss von Isoprenoid-Vorläufern im Zytosol zu verbessern, wollten wir den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Mevalonat-Signalwegs abschwächen, indem wir eine verkürzte 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (tHMGR) aus Hafer koinfiltrierten, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die Titer verbessert des Triterpenoids β-Amyrin in N. benthamiana42. Wenn alle Enzyme im Zytosol lokalisiert waren, war der Fluss durch den Secoiridoid-Weg minimal (ca. 90-fache Reduzierung für 7-DLA), während die Lokalisierung aller Enzyme des Wegs im Chloroplasten zu einer 5-fach geringeren Menge an 7-DLA führte (Abb. 6a, Ergänzende Daten 1). Die besten Ausbeuten an 7-DLA (Abb. 6a, Ergänzende Daten 1) und Strictosidin (Abb. 6b, Ergänzende Daten 1) wurden mit Chloroplasten-Lokalisierung des frühen Signalwegs und zytosolischer Lokalisierung nachfolgender Schritte erzielt, was das native Lokalisierungsmuster nachahmte C. roseus. Die Produktion von 7-DLA im Chloroplasten wird möglicherweise durch die Verfügbarkeit von Partner-P450-Reduktasen für G8H und Iridoidoxidase (IO) oder niedermolekularen Substraten wie UDP-Glucose für 7-DLGT begrenzt, jedoch sind alle möglichen Aufteilungen von Stoffwechselwegenzymen zwischen den Cytosol und Chloroplasten produzieren immer noch 7-DLA, was darauf hindeutet, dass Zwischenprodukte des Signalwegs die Chloroplastenmembran passieren können.

Die Verlagerung der Biosynthesegene für 7-DLA (a) und Strictosidin (b) in das Zytosol (blau) oder den Chloroplasten (grün) verringert die Produktausbeute. tHMGR, verkürzte 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase. Werte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler von n ≥ 3 biologischen Replikaten (unabhängige Blattproben) dar.

In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, die Produktion biosynthetischer Zwischenprodukte und Produkte des Iridoid- und MIA-Wegs in N. benthamiana zu verbessern. Frühere Studien haben berichtet, dass, wenn N. benthamiana als Wirt für die heterologe Expression terpenoider Naturstoffe verwendet wird, sich eine Vielzahl von Terpenoidderivaten ansammeln, was möglicherweise die Verwendung dieser Art als Chassis für die Produktion einiger Molekültypen einschränkt8,9, 10,11,12,13,14. Wie in früheren Studien festgestellt, haben wir hier beobachtet, dass frühe Iridoid-Biosynthese-Zwischenprodukte häufig durch die Zugabe von Pentose- und Hexose-Zuckern modifiziert wurden, was auf die Beteiligung von UGTs der N. benthamiana-Familie 1 schließen lässt (Abb. 1 und Ergänzungstabelle 1). Obwohl bereits bekannt ist, dass die Genexpression durch Agroinfiltration beeinflusst wird, ergaben vergleichende Transkriptomstudien, dass die Expression einiger endogener UGTs durch die Expression von Monoterpen- oder Iridoid-Stoffwechselwegen weiter moduliert wird (Ergänzungstabelle 2). Dies weist darauf hin, dass Pflanzen nicht nur auf die Infiltration von Agrobacterium reagieren, sondern auch auf die Anwesenheit fremder Enzyme und/oder Metaboliten.

Obwohl N. benthamiana nicht viele Monoterpene anreichert, könnten diese endogenen UGTs an der Biosynthese größerer dekorierter Metaboliten beteiligt sein und somit promiskuitiv auf die frühen Iridoid-Zwischenprodukte einwirken. Alternativ können sie Teil eines xenobiotischen Entgiftungsmechanismus zum Schutz vor bioaktiven Stoffen sein, die von Krankheitserregern produziert werden. Wir kamen zu dem Schluss, dass diese Enzyme wahrscheinlich nicht essentiell sind, und konzentrierten uns auf die Verbesserung des N.-benthamiana-Chassis durch Identifizierung und Eliminierung der Aktivität dieser Enzyme. Wir verwendeten Cas9-basierte molekulare Werkzeuge, um Funktionsverlustmutationen in 20 UGT-Zielgene einzuführen (Tabelle 1 und ergänzende Abbildungen 2–5). Wir verwendeten zwei Ansätze: die Produktion transgener Pflanzen, die Cas9 zusammen mit mehreren sgRNAs45 konstitutiv exprimieren, und die kürzlich beschriebene Verwendung eines viralen Vektors zur vorübergehenden Expression mobiler sgRNAs in Pflanzen, die ein Cas9-Transgen tragen38. Während wir mit der ersten Methode in der Lage waren, Linien mit Mutationen in den meisten oder allen Ziellinien wiederherzustellen, war die mobile sgRNA-Methode zwar weniger effizient, aber weniger aufwändig und konnte einfacher auf die Untersuchung vieler Zielgene skaliert werden.

Im Vergleich zu Kontrolllinien akkumulierten Pflanzen mit Mutationen im UGT der Gruppe A, NbUGT94E7, nicht mehr den Peak, der mutmaßlich Trihexosylgeransäure zugeordnet wurde (m/z 699,2713, [M + HCOOH-H]) (Abb. 3, ergänzende Abb. 6). und 7). Dieser UGT fehlt auch das GSS-Motiv, von dem angenommen wird, dass es für die Definition der Schleifenstruktur von Monoglucosyltransferasen wichtig ist37,39,40,41,42,43,44,46. Wir stellten außerdem fest, dass im Vergleich zu Kontrolllinien vier Peaks in Pflanzen mit Mutationen im UGT der Gruppe G, NbUGT85A73, verringert waren oder fehlten (Abb. 3 und ergänzende Abb. 6 und 7). Es wurde zuvor berichtet, dass dieser UGT auf Geraniol aktiv ist37. Überraschenderweise wurden diese Peaks nur in Pflanzen eliminiert, die mit allen zur Produktion von Nepetalactol erforderlichen Stoffwechselenzymen infiltriert waren, und blieben bestehen, wenn Stoffwechselgene für die Expression von Geraniol vorhanden waren. Es ist wahrscheinlich, dass Hexosylhydroxygeraniol (m/z 377,1817, [M + HCOOH-H]) und Hexosylhydroxycitronellal (m/z 379,1974, [M + HCOOH-H]) durch Glykosylierung von 8-Hydroxygeraniol hergestellt werden und daher den Ausdruck erfordern von Geraniol-8-Oxidase. Es ist jedoch unklar, warum die Anreicherung von Pentosylhexosylgeraniol (m/z 493,2288, [M + HCOOH-H]) und Acetyldihexosylgeraniol (m/z 519,22425, [MH]) nur dann verringert wurde, wenn der erweiterte Weg infiltriert wurde.

Unser Ansatz liefert einen Proof-of-Concept für die Anwendung von Gen-Editing-Ansätzen zur Verbesserung von N. benthamiana als Bioproduktions-Chassis für kleine, terpenoidartige Moleküle durch Reduzierung der Anreicherung von Derivaten. Wir beobachteten jedoch, dass Mutationen einzelner UGTs jeweils die Anhäufung kleinerer Peaks verringerten. Um eine Wirkung zu erzielen, kann die Produktion von Linien mit Mutationen in mehreren Genen erforderlich sein, um die Ausbeute an relevanten Metaboliten dramatisch zu beeinflussen. Wir fanden auch heraus, dass mit der Verlängerung des Signalwegs durch die Koexpression zusätzlicher Enzyme weniger Derivat-Peaks beobachtet werden (Abb. 1, 4 und 5). Dies deutet darauf hin, dass die Enzyme des Signalwegs eine hohe Affinität zu den Substraten haben und, insbesondere wenn sie von starken Promotoren exprimiert werden, höchstwahrscheinlich in der Lage sind, endogene Enzyme um Substrate zu übertreffen. Strictosidin ist ein polares, glykosyliertes Molekül, das wahrscheinlich zur Lagerung in der Vakuole sequestriert wird und weniger anfällig für Derivatisierung ist als seine hydrophoben Iridoid-Vorläufer. Wenn der Strictosidin-Weg in Linien exprimiert wurde, die weniger Derivate oder Zwischenprodukte des frühen Weges produzierten, gab es tatsächlich keine Änderung der Ausbeute im Vergleich zur Expression im Wildtyp-N. benthamiana (ergänzende Abbildung 13).

Wir konnten die Produktion großer Mengen Strictosidin (0,23 ± 0,11 mg/g DW) aus dem Zentralstoffwechsel in einem photosynthetischen Organismus nachweisen. Wir haben auch die Produktion von Strictosidin gesteigert, indem wir den für die Bildung von Nepetalactol erforderlichen Schlüsselcyclisierungsschritt verbessert haben. Die Pflanzengattung Nepeta L., umgangssprachlich auch Katzenminze oder Katzenminze genannt, nutzt den frühen Teil des Secoiridoid-Weges zur Produktion von Nepetalactonen. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass die Produktion von cis-trans-Nepetalactol durch MLPL in Nepeta unterstützt wird41. Die heterologe Expression von MLPL aus N. mussinii zur Unterstützung der Zyklisierung des reaktiven Enolprodukts von ISY überwand Engpässe im Secoiridoid-Weg (Abb. 4) und war entscheidend für die Ermöglichung der heterologen Produktion von Strictosidin in N. benthamiana (Abb. 5). MLPL verbessert in ähnlicher Weise das Secoiridoid-Metabolic-Engineering in Mikroorganismen wie Hefe31. Darüber hinaus umfasste eine zellfreie In-vitro-Eintopf-Enzymkaskade MLPL mit neun weiteren Enzymen, akzessorischen Proteinen und Cofaktor-Regenerationsenzymen, um etwa 1 g/L Nepetalacton zu produzieren42.

Der MIA-Weg in C. roseus ist stark in subzelluläre Kompartimente und Zelltypen unterteilt. Der erste festgelegte Schritt ist die Geraniolsynthese (GES), die im Chloroplasten interner Phloem-assoziierter Parenchymzellen lokalisiert ist. Um die Substratverfügbarkeit für GES zu erhöhen, exprimierten wir GPPS aus P. abies48, das auch von Miettinen und Mitarbeitern14 genutzt wurde. Die Expression von Chloroplasten-gerichtetem PaGPPS verbesserte den Ertrag um das ~5-Fache (Abb. 5), was mit zuvor berichteten Auswirkungen auf die Produktion von Geraniol übereinstimmt13. Bemerkenswert ist, dass PaGPPS nahezu identisch (ergänzende Abbildung 14) mit einem GPPS aus Picea glauca ist, von dem in vitro gezeigt wurde, dass es im Vergleich zu sechs anderen GPPS-Sequenzen, die üblicherweise in der Terpen-Stoffwechseltechnik verwendet werden, höhere Mengen des Monoterpens Limonen produziert. Wir haben auch DXS von C. roseus co-exprimiert. Interessanterweise hatte CrDXS relativ geringe Auswirkungen auf die Ausbeute an Striktosidin, im Gegensatz zu zuvor berichteten Auswirkungen von DXS auf die Produktion von Diterpenoiden10,50.

Jüngste Bemühungen zur Entwicklung von Stoffwechselwegen haben Vorteile bei der Veränderung der Kompartimentierung von Stoffwechselwegenzymen ergeben13,51. Beispielsweise wurde der Weg zur Herstellung des cyanogenen Glucosids Dhurrin in den Chloroplasten von Nicotiana tabacum verlegt, wo Ferredoxin, reduziert über die photosynthetische Elektronentransportkette, als effizienter Elektronendonor für die beiden Cytochrom P450s (CYPs) innerhalb des Weges dienen kann52. Darüber hinaus führte die Lokalisierung von Enzymen, die die späten Schritte des Artemisinin-Wegs zum Chloroplasten in N. tabacum kodieren, zu höheren Mengen an Artemisinin (800 µg/g DW)53 und Artemisinsäure (~1200 µg/g DW)54 im Vergleich zur Lokalisierung innerhalb das Zytosol (6,8 µg/g DW Artemisinin)55. Dieser Anstieg ist möglicherweise auf die Isolierung von Metaboliten aus dem Zytosol zurückzuführen, wo sie sowohl die Lebensfähigkeit beeinträchtigen als auch einer unerwünschten Derivatisierung durch endogene Glykosyltransferasen ausgesetzt sein können11,12,56. Auch die Produktion von halogeniertem Indican57 und Vanillin58 in N. benthamiana profitierte von der Chloroplastenlokalisierung. Im Gegensatz dazu wurde in einem kürzlich veröffentlichten Bericht festgestellt, dass die Produktion von Diterpenoiden (typischerweise im Chloroplasten synthetisiert) durch die Nutzung des zytosolischen Mevalonat-Wegs zur Produktion von GGPP anstelle des Chloroplasten-MEP-Wegs dramatisch gesteigert wurde59.

In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass die optimale Konfiguration für die Rekonstruktion des Strictosidin-Wegs in N. benthamiana-Blättern darin besteht, dem Lokalisierungsmuster von C. roseus zu entsprechen, das den MEP-Weg des Chloroplasten für Isoprenoid-Vorläufer nutzt, um Geraniol zu produzieren und dann die verbleibenden Enzyme des Wegs darin zu lokalisieren das Zytosol (Abb. 4). Wir gehen davon aus, dass die Monoterpenproduktion im Zytosol begrenzt ist, da das von GPPS produzierte GPP (10 Kohlenstoffatome) auch das Substrat für die Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) aus N. Benthamiana ist, die Farnesylpyrophosphat (FPP) (15 Kohlenstoffatome) produziert. Diese Hypothese wird durch Daten gestützt, die darauf hindeuten, dass alle vier Kopien von NbFPPS hochreguliert sind, um als Reaktion auf Phytophthora infestans sesquiterpenoide Phytosterole und Phytoalexine zu produzieren60. A. tumefaciens löst auch eine weitreichende transkriptionelle Umgestaltung aus, wenn es in N. benthamiana infiltriert wird35. Diese Konkurrenz zwischen GES und FPPS könnte auch die zuvor berichteten höheren Gehalte an Geraniol und Geraniolderivaten im Plastiden erklären13. Zukünftige Bemühungen zur bedingten Inaktivierung von NbFPPS während der heterologen Produktion könnten eine Metabolic-Engineering-Strategie ermöglichen, die sowohl den plastidären als auch den zytosolischen Weg zur Geraniolproduktion nutzen könnte.

Bei C. roseus diffundiert oder wird Geraniol vom Plastid in das Zytosol transportiert, um mit G8H zu reagieren, das an der Außenseite der ER-Membran gebunden ist. Die nächsten Schritte (G8H zur Desoxylogansäurehydroxylase (7-DLH)) sind im Zytosol von Phloem-assoziierten Parenchymzellen aktiv, wobei zwei CYPs (G8H und IO) ebenfalls an der ER-Membran verankert sind14. Logansäure wird dann von NPF2.4/5/661 zu Epidermiszellen transportiert, wo vier weitere Enzyme (LAMT bis Strictosidin-Synthase (STR)) Strictosidin produzieren62,63. Tryptamin und Secologanin werden in die Vakuole importiert, wo Strictosidin synthetisiert und akkumuliert wird, wobei der Export von Strictosidin durch den Transporter NPF2.964 vermittelt wird. Somit interagieren wahrscheinlich vier Signalweg-CYPs (G8H, IO, 7-DLH und Secologanin-Synthase) mit endogenen CYP-Reduktasen von N. benthamiana für den Elektronentransfer von NADPH zu den CYPs. Es ist möglich, dass die notwendigen CYP-Reduktasen im Chloroplasten weniger häufig vorkommen und somit die Akkumulation von Strictosidin in diesem Kompartiment begrenzen. Es ist auch möglich, dass die CYP450 nicht ordnungsgemäß in der Membran verankert sind oder dass ein höherer Stroma-pH-Wert des Chloroplasten (~8,0)65 die Enzymaktivität im Vergleich zum Zytosol (pH-Wert ~7,0) hemmt. Wir haben auch das Fehlen eines zusätzlichen Cofaktors für LAMT, S-Adenosylmethionin (SAM), in Betracht gezogen, um die geringe Striktosidinproduktion (im Vergleich zu 7-DLA) im Chloroplasten zu erklären. Es ist jedoch bekannt, dass dieses kleine Molekül aktiv in das Plastid transportiert wird66 und ein essentielles Substrat für ChlM (Mg-Protoporphyrin-IX-Methyltransferase) ist, das an der Chlorophyll-Biosynthese im Chloroplasten beteiligt ist.

Die Produktion von Strictosidin in Planta eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung einer Vielzahl von MIA-Produkten mittels biologischer Synthese. Obwohl der endogene Stoffwechsel dieser Art die Anreicherung von Monoterpenen beeinträchtigt, ermöglicht er die Ansammlung komplexer Moleküle. Insbesondere da neue Biosynthesewege für weitere MIAs entdeckt werden (z. B. die süchtig machende Verbindung Ibogain67, das Antimalariamittel Chinin68), ist die Möglichkeit, diese Arbeit im Plug-and-Play-Verfahren mit nachgeschalteten Biosynthesemodulen zu koppeln, eine spannende Aussicht für Naturstoffe Synthese.

Binäre Vektoren für die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte transiente Expression (Agroinfiltration) wurden entweder durch Klonieren von aus C. roseus-cDNA amplifizierten kodierenden Sequenzen in den pEAQ-HT-DEST1-Vektor (GenBank GQ497235, Ergänzungstabelle 4)69 zusammengesetzt oder unter Verwendung der Pflanze zu Expressionskonstrukten zusammengesetzt Modulares Klonen (MoClo) Toolkit70. Für Letzteres wurden kodierende Sequenzen entweder synthetisiert (Twist Bioscience, San Francisco, CA), wobei jegliche native Chloroplasten-Transitpeptidsequenz sowie alle Instanzen von BpiI-, BsaI-, BsmBI- und SapI-Erkennungsstellen durch Einführung einer synonymen Mutation entfernt wurden, oder sie wurden aus C amplifiziert .roseus-cDNA durch PCR mit Überhängen, die BpiI (BbsI)-Erkennungsstellen enthalten. Amplikons wurden wie zuvor beschrieben in pUAP1 (Addgen Nr. 63674) kloniert71, was zu Teilen der Stufe 0 (Addgen Nr. 177019 – 177032) führte, flankiert von einem invertierten Paar von BsaI-Erkennungsstellen, die Überhänge erzeugen, die mit dem Phytobrick-Assembly-Standard kompatibel sind72 (Ergänzungstabelle 5). Diese Level-0-Teile wurden in einer einstufigen Klonierungsreaktion71 zu Level-1-Akzeptoren zusammengesetzt, wobei Level-0-Teile für den CaMV-35-Promotor (CaMV35s) und 5'-UTR des Tabakmosaikvirus (TMV) sowie, falls erforderlich, einen synthetischen Chloroplastentransit kodierten Peptidsequenz (Ergänzungstabelle 6), um die subzelluläre Lokalisierung zu verändern.

N. benthamiana-Pflanzen wurden in einem Raum mit kontrollierter Umgebung mit 16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit bei 22 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit und einer Lichtintensität von ~200 µmol/m2/s gezüchtet. Elektrokompetente A. tumefaciens GV3101 (MoClo-Vektoren) oder LBA4404 (pEAQ-Vektoren) wurden mit dem binären Plasmid transformiert, das das Gen von Interesse kodiert, und eine einzelne Kolonie wurde verwendet, um flüssiges LB-Medium zu beimpfen, das Antibiotika 50 μg/ml Rifampicin und 20 μg/ml Gentamicin enthielt und 100 μg/ml Carbenicillin (MoClo-Vektoren) oder 50 μg/ml Rifampicin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 μg/ml Kanamycin (pEAQ-Vektoren). Über Nacht gesättigte Kulturen wurden 30 Minuten lang bei 3400 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert und die Zellen wurden in Infiltrationsmedium (10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 5,7, 10 mM MgCl2, 200 µM 3′,5, resuspendiert ′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenon (Acetosyringon)) gelöst und 2–3 Stunden bei Raumtemperatur unter langsamem Schütteln inkubiert. Alle resuspendierten Kulturen wurden auf 0,8 OD600nm (MoClo) oder 0,5 OD600nm (pEAQ) verdünnt und je nach Versuchsbedingungen in gleichen Verhältnissen gemischt. Bei MoClo-Vektoren wurde in jede Infiltration ein separater A. tumefaciens-Stamm einbezogen, der ein Gen kodiert, das den P19-Suppressor der Gen-Stummschaltung des Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) exprimiert, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er die heterologe Expression erhöht69. Gesunde Pflanzen (29–37 Tage alt) mit 3–4 vollständig ausgebreiteten echten Blättern wurden mit einer nadellosen 1-ml-Spritze auf der abaxialen Seite des Blattes infiltriert und fünf Tage lang in einer MLR-352-PE-Pflanzenwachstumskammer (Panasonic Healthcare) gezüchtet Co, Oizumi-Machi, Japan) mit 16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit bei 22 °C und 120–180 µmol/m2/s Lichtintensität. Alle chemischen Verbindungen wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekauft.

Fünf Tage nach der Infiltration wurden 100–300 mg infiltriertes N. benthamiana-Blattgewebe in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Blattgewebe wurde über Nacht mit einem VirTis BenchTop SLC-Gefriertrockner (SP Industries, Stone Ridge NY, USA) lyophilisiert, der auf –49 ° C und 300 mTorr eingestellt war. Anschließend wurden die Proben mit einer 3 mm großen Wolframkarbidperle (Qiagen Kat.-Nr./ID: 69997) auf einem TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Deutschland) 20 Sekunden lang zu Pulver gemahlen. Lyophilisiertes Blattgewebe wurde mit 70 % Methanol + 0,1 % Ameisensäure (1:100, wv) extrahiert. Das Lösungsmittel enthielt 10 µM Harpagosid (Extrasynthese, Genay, Frankreich) als internen Standard. Die Extraktionen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 10-minütiger Ultraschallbehandlung und 50-minütigem konstantem Schütteln durchgeführt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert, um die Trümmer abzutrennen, und vor der Analyse durch Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC/MS) durch 0,2-µm-PTFE-Scheibenfilter filtriert.

Die UPLC/MS-Analyse wurde mit einem Impact II qTOF-Massenspektrometer (Bruker) durchgeführt, das an ein Elute UPLC (Bruker)-Chromatographiesystem gekoppelt war. Die chromatographische Trennung wurde auf einer Phenomenex-Kinetex-Säule Acetonitril). Die Flussrate betrug 600 μl/min. Die Säule wurde mit 99 % A und 1 % B äquilibriert. Während der ersten Minute der Chromatographie erreichte Lösungsmittel B 5 %. Anschließend ermöglichte ein linearer Gradient von 5 % B auf 40 % B in 5 Minuten die Trennung der interessierenden Verbindungen. Die Säule wurde dann 1,5 Minuten lang mit 100 % B gewaschen und erneut auf 1 % B äquilibriert. Das Injektionsvolumen betrug 2 μl. Die Massenspektrometrie wurde sowohl im Positiv- als auch im Negativionenmodus mit einem Scanbereich m/z 100–1000 durchgeführt. Das Massenspektrometer wurde mit Natriumformiat-Addukten kalibriert. Die Quelleneinstellungen waren die folgenden: Kapillarspannung 3,5 kV, Zerstäuber 2,5 Bar, Trockengas 11,0 L/min, Trockentemperatur 250 °C. Die Datenanalyse wurde mit der Bruker Data Analysis-Software durchgeführt. Die Quantifizierung von 7-Desoxylogansäure (7-DLA), Loganin, Logansäure und Strictosidin basierte auf Kalibrierungskurven, die mit reinen Verbindungen erstellt wurden. Loganin und Logansäure wurden von Sigma bezogen. 7-Desoxylogansäure und Strictosidin wurden wie zuvor beschrieben synthetisiert73,74. Die Standards wurden in 70 % Methanol + 0,1 % Ameisensäure verdünnt, um neun Kalibriersubstanzen mit Konzentrationen zwischen 40 nM und 10 µM zu ergeben. Für alle Verbindungen in diesem Konzentrationsbereich wurde eine lineare Reaktion beobachtet (R2 > 0,993). Die mutmaßliche Identifizierung von Metaboliten basierte auf der Erfassung hochauflösender Massenspektrometriedaten, um mithilfe der Datenanalysesoftware (Bruker) die am besten geeignete Elementzusammensetzung zu bestimmen.

Agroinfiltrationsexperimente wurden wie oben beschrieben mit vier Sätzen von pEAQ-Vektoren durchgeführt: (1) geringer Geraniolgehalt (GFP, CrGES), (2) hoher Geraniolgehalt (GFP, CrDXS, CrGGPPS.LSU, CrGES), (3) Nepetalactol (GFP, CrDXS). , CrGGPPS.LSU, CrGES, CrG8H, Cr8HGO, CrISY) und (4) eine Infiltrationskontrolle (nur GFP) (Ergänzungstabelle 7). Blattgewebe von drei biologischen Replikaten jeder Bedingung und einer scheininfiltrierten Kontrolle wurden fünf Tage nach der Infiltration gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) mit rekombinanter DNase I-Behandlung (Roche) isoliert. Bibliotheken wurden auf einer Sciclone® G3 NGSx-Workstation (PerkinElmer, Waltham, MA) unter Verwendung des TruSeq RNA-Protokolls v2 (Illumina 15026495 Rev.F) erstellt. Die RNA-Qualität wurde mit dem Quant-iT™ RNA Assay Kit (Life Technologies/Invitrogen Q-33140) bewertet. 1 µg RNA wurde gereinigt, um polyadenylierte mRNA unter Verwendung von Biotinkügelchen zu extrahieren, fragmentiert und mit zufälligen Hexameren geprimt, um Erststrang-cDNA zu erzeugen, gefolgt von einer Zweitstrangsynthese, um ds-cDNA zu erzeugen. Die Probenenden wurden abgestumpft und A-Endstücke sowie Indexierungsadapter mit entsprechenden T-Überhängen wurden abgebunden. Die ligierten Produkte wurden nach ihrer Größe ausgewählt und nicht ligierte Adapter wurden mit XP-Perlen (Beckman Coulter A63880) entfernt. Die Proben wurden mit einem Cocktail aus PCR-Primern an den Adaptern amplifiziert. Die Insertgröße der Bibliotheken wurde mit LabChipGX (PerkinElmer 5067–4626) und DNA High Sensitivity DNA-Reagenzien (PerkinElmer CLS760672) überprüft. Äquimolare Mengen jeder Bibliothek wurden gepoolt, fünf Bibliotheken pro Pool, und auf einer Spur eines HiSeq 2500 sequenziert, wodurch 100 Basenpaar-Paired-End-Reads erzeugt wurden. Die Datenanalyse wurde über eine webbasierte Galaxy-Schnittstelle (https://galaxy.earlham.ac.uk)75 durchgeführt. Der Entwurf der N. benthamiana-Genomassemblierung v0.5 http://benthgenome.qut.edu.au/76 wurde um das Genom und die Plasmide von Agrobacterium C58 erweitert (Genbank AE007869.2, AE007870.2, AE007871.2 und AE007872). .2) sowie die zur Infiltration verwendeten pEAQ-Vektoren (Ergänzungstabelle 4). Alle kurzen Lesevorgänge von RNA-seq wurden unter Verwendung der Standardparameter von hisat2 v2.1.0 auf das erweiterte Genom abgebildet. Zusammengesetzte Transkripte wurden mit Stringtie v1.3.3.1 erstellt. Transkripte von n = 15 experimentellen Proben wurden mit Stringtie Merge v1.3.3 konsolidiert. Alle kurzen Lesevorgänge wurden erneut mit hisat2 v2.1.0 auf das erweiterte Genom ausgerichtet (diesmal mit dem zusammengeführten Transkriptom als Referenz). Differentialausdruckstabellen wurden mit DESeq2 v2.11.40.1 generiert. Transkripte aus dem fusionierten Transkriptom wurden mit Transdecoder übersetzt und die längsten Kodierungssequenzen mit Phmmer v3.1v2 mit der Swiss-Prot-Proteindatenbank (abgerufen im Mai 2018) als Referenz annotiert.

N. benthamiana-Transkripte, die Sequenzen kodieren, die als Glykosyltransferasen der Familie 1 (GT1, Proteinfamilie (Pfam) PF0201 oder PF3033) gekennzeichnet sind, wurden analysiert. Das Ergebnis waren 77 Sequenzen mit mehr als 327 Aminosäuren, einschließlich einer intakten Box für pflanzliche Sekundärprodukt-Glykosyltransferasen (PSPG). Proteinsequenzen von 107 UGTs aus Arabidopsis thaliana wurden wie in beschrieben von der A. thaliana-Cytochrom-P450-, Cytochrom-b5-, P450-Reduktase-, b-Glucosidase- und Glycosyltransferase-Stelle (http://www.p450.kvl.dk) erhalten33. Weitere 9 UGT-Sequenzen, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie Aktivität auf Geraniol oder andere Iridoidsubstrate von Actinidia deliciosa (Kiwis)77, Camellia sinensis (Tee)78, C. roseus79, Gardenia jasminoides (Kapjasmin)80, Sorghum bicolor81, Vitis vinifera (Traube) haben )82,83 waren ebenfalls enthalten. Sequenzen und Zugangsnummern sind in der Ergänzungstabelle 8 aufgeführt. Die 193 Sequenzen wurden mit MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) abgeglichen und ein phylogenetischer Baum mit 100 Bootstraps wurde mit RAxML Version 8.2.1184 im Geneious-Programm generiert. Phylogenetische Bäume wurden mit Interactive Tree Of Life (iTOL)85 visualisiert.

Binäre Vektoren, die Cas9 und Single Guide RNAs (sgRNAs) für die gewünschten Ziele exprimieren, wurden mit dem Plant Modular Cloning Toolkit71 wie zuvor beschrieben45 zusammengestellt. Kurz gesagt, Primer, die für den gewünschten sgRNA-Spacer kodieren (Ergänzungstabelle 9), wurden zur PCR-Amplifikation des von Chen und Mitarbeitern beschriebenen sgRNA-Stammverlängerungsgerüsts verwendet86. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde mit einem Level-0-Teil zusammengesetzt, der entweder einen Arabidopsis-U6–26-Promotor (AtU6–26-Addgen#68261) oder einen N.-benthamiana-U6-Promotor (NbU6-1-Addgen#185623 und NbU6-2-Addgen#185624) kodiert ( Ergänzungstabelle 9). U6-Promotoren von N. benthamiana wurden durch Sequenzhomologie zu Arabidopsis U6–26 identifiziert und die Wirksamkeit wurde durch vorübergehende Infiltration wie zuvor beschrieben bestätigt45. Die resultierenden Konstrukte der Stufe 1 wurden mit synthetischen Genen zusammengesetzt, die Resistenz gegen Kanamycin verleihen und für die konstitutive Expression von Cas9 sorgen (ergänzende Abbildung 15). Die Wirksamkeit von sgRNAs wurde durch vorübergehende Infiltration wie zuvor beschrieben bestätigt45. Die resultierenden Konstrukte wurden zur Pflanzentransformation in den hypervirulenten A. tumefaciens-Stamm AGL1 transformiert. Eine einzelne Kolonie wurde verwendet, um 10 ml LB-Medium mit Antibiotika (50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin) zu beimpfen. Über Nacht gesättigte Kulturen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3000 × g zentrifugiert und die Zellen wurden in 10 ml MS-Medium mit 100 μM Acetosyringon und einer auf 0,6–0,8 eingestellten optischen Dichte OD600 resuspendiert. N. benthamiana wurde wie zuvor berichtet87 mit geringfügigen Modifikationen transformiert. Junge Blätter wurden von 4 Wochen alten, nicht blühenden Pflanzen geerntet und oberflächensterilisiert. 1–2 cm große Quadrate wurden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Agrobacterium inokuliert, auf sterilem Filterpapier trockengetupft und mit der abaxialen Seite nach unten auf Co-Kultivierungsmedium pH 5,8 gelegt, das MS-Basalsalz88, Gamborgs B5-Vitamine89, 3 % (Gew./Vol.) enthielt. Saccharose, 0,59 g/L MES-Hydrat, 6 g/L Agarose, 6-Benzylaminopurin (BAP, 1,0 mg/L) und Naphthalinessigsäure (NAA, 0,1 mg/L). Die Explantate wurden 3 Tage lang unter weißem Fluoreszenzlicht (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) bei 22 ± 2 °C kokultiviert und dann auf Selektionsmedium übertragen, das MS-Basalsalze, Gamborgs B5-Vitamine, 3 % (Gew./Vol.) Saccharose, 0,59 enthielt g/L MES-Hydrat, 6 g/L Agargel, 6-Benzylaminopurin (BAP, 1,0 mg/L) und Naphthalinessigsäure (NAA, 0,1 mg/L), 100 mg/L Kanamycin und 320 mg/L Ticarcillin. Die Explantate wurden in Abständen von 14 Tagen auf frischem Selektionsmedium subkultiviert. Mutmaßliche transgene Sprosse wurden auf Bewurzelungsmedien kultiviert, die MS-Salze mit Vitaminen (halbe Stärke), ergänzt mit 1 mg/L Indol-3-Buttersäure, 0,5 % Saccharose, 0,3 % Gelrite, 100 mg/L Kanamycin und 320 mg/L Ticarcillin, enthielten . Die Pflänzchen wurden in sterilen Torfblöcken (Jiffy7) in MagentaTM-Gefäßen (Sigma) überführt, bevor sie in torfbasierten Kompost (90 % Torf, 10 % Splitt, 4 kg/m3 dolomitischer Kalkstein, 0,75 kg/m3 Mehrnährstoffdünger (PG Mix)) umgepflanzt wurden ™), 1,5 kg/m3 Dünger mit kontrollierter Freisetzung (Osmocote Bloom)) und in ein Gewächshaus überführt.

Ein TRV2-Plasmidvektor SPDK3888 (Addgen #149276) wurde dankbar von Savithramma Dinesh-Kumar und Dan Voytas erhalten. Dies wurde durch Hinzufügen von AarI-Restriktionsstellen und einer lacZ-Kassette zur Selektion modifiziert, wodurch pEPQD0KN0750 (Addgene#185627) entstand. Spacer-Sequenzen für ausgewählte Ziele wurden durch Golden-Gate-Assemblierung in AarI-Stellen wie zuvor beschrieben in pEPQD0KN0750 eingebaut (Ergänzungstabelle 10). Konstrukte wurden in A. tumefaciens GV3101 transformiert und eine einzelne Kolonie wurde zum Beimpfen von LB-Medium mit 50 μg/ml Rifampicin, 20 μg/ml Gentamicin und 50 μg/ml Kanamycin verwendet und über Nacht unter Schütteln bei 28 °C gezüchtet. Gesättigte Kulturen wurden zentrifugiert und wie oben beschrieben in Infiltrationsmedium resuspendiert, mit der Ausnahme, dass die Kulturen auf 0,3 OD600 nm verdünnt wurden und Agrobacterium-Stämme im gleichen Verhältnis mit einem Stamm gemischt wurden, der pTRV1 (Addgene #148968) enthielt. Samen von transgenen N. benthamiana-Pflanzen, die Cas9 (Cas9 Benthe 193.22 T5 Homozygot) konstitutiv exprimieren, wurden dankbar von Dan Voytas erhalten und 6 Wochen lang in einem Gewächshaus bei 22 ± 2 °C gezüchtet. Die Pflanzen wurden wie oben beschrieben infiltriert und 13 Wochen lang wachsen gelassen, bevor Blattgewebeproben von zwei verschiedenen Stämmen (mit A und B bezeichnet) entnommen wurden.

Proben von 40–60 mg Blattgewebe wurden von T0-Pflanzen gesammelt, die durch Agrobacterium-vermittelte stabile Transformation erzeugt wurden, oder von Blättern, die von zwei Stämmen von Pflanzen entnommen wurden, die mit RNA-Viren infiltriert waren, die mobile sgRNAs exprimierten. Genomische DNA wurde wie zuvor beschrieben isoliert45. Zielorte wurden unter Verwendung einer Korrekturlesepolymerase (Q5® High-Fidelity DNA Polymerase, New England Biolabs, Ipswich, MA) und Primern, die die Zielstellen flankierten, amplifiziert (Ergänzungstabelle 11). Amplikons wurden durch Sanger-Sequenzierung (Eurofins, Luxemburg) sequenziert. Amplikons mit mehreren Peaks, die auf das Vorhandensein von genetischem Chimärismus, heterozygoten oder biallelischen Mutationen hindeuteten, wurden durch Klonen von Amplikons in Zero Blunt™ TOPO™ (Thermo Fisher, Waltham, MA) oder pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI) aufgelöst. Anschließend erfolgt die Sequenzierung der aus 10–15 Kolonien isolierten Plasmide. Für Pflanzen, die durch Agrobacterium-vermittelte stabile Transformation erzeugt wurden, wurde die T-DNA-Kopienzahl von T0-Pflanzen durch ddPCR wie zuvor beschrieben90 unter Verwendung von Primern für nptII und dem Einzelkopie-Referenzgen Rdr191 geschätzt. T1-Samen von Einzelkopiepflanzen mit homozygoten, heterozygoten oder biallelischen Mutationen an Zielorten wurden gesammelt und für nachfolgende Analysen gezüchtet. Für Pflanzen, die mit RNA-Viren und mobilen sgRNAs erzeugt wurden, wurden Samen (bezeichnet als E1) aus einzelnen Schoten am distalen Ende der Stängel geerntet, in denen Mutationen nachgewiesen wurden. T1 und E1 wurden gezüchtet und der Genotyp jedes Zielloci wurde wie oben bestätigt.

Für die Transkriptomanalyse, die Bewertung von Derivatpeaks in mutierten Pflanzen und die Quantifizierung des Ertrags wurden mindestens n = 3 biologische Replikate verwendet. Schlüsselexperimente, einschließlich der Quantifizierung von 7-Desoxylogansäure (7-DLA) und Strictosidin, wurden so wiederholt, dass n = 6 oder n = 11. Änderungen im Ertrag wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Post-hoc-Tukey-HSD analysiert. Es wurden keine Daten ausgeschlossen. Die Anordnung der in Blätter agroinfiltrierten Proben wurde innerhalb eines bestimmten Experiments randomisiert über Blätter und Pflanzen verteilt. Zur Identifizierung von Derivaten und Quantifizierung von Metabolitenprodukten wurden der Versuchsaufbau, die Blattinfiltration und die Probenentnahme von einem Forscher durchgeführt und die Proben von einem anderen Forscher blind analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Sequenzen und DNA-Proben von Plasmiden wurden bei Addgene hinterlegt (#177019 – #177092). Transkriptomdaten wurden in der NCBI Sequence Read Archive-Datenbank unter der Projekt-ID PRJNA841421 hinterlegt. Numerische Quelldaten für alle Diagramme finden Sie in den Zusatzdaten 1.

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Wir danken Benjamin Lichman für die Anleitung zur Arbeit mit MLPL. Wir danken außerdem Nicola Soranzo für ihre Hilfe bei der RNAseq-Analyse innerhalb von Galaxy und Yaomin Cai für ihre Hilfe bei der Datenverwaltung und -übermittlung. pL0-AstHMGR war ein großzügiges Geschenk von Anne Osbourn. Die Plasmide pNJB069 (pTRV1), pEE393 und pEE515 sowie Samen von N. benthamiana, die SpCas9 exprimieren, waren ein großzügiges Geschenk von Dan Voytas. Die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung wurde über die BBSRC National Capability in Genomics and Single Cell Analysis (BBS/E/T/000PR9816) am Earlham Institute durch Mitglieder der Genomics Pipelines Group durchgeführt. Wir danken außerdem Lesley Phillips, Catherine Taylor und JIC Horticultural Services für ihre Hilfe bei der Pflanzenzucht. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC), einem Teil von UK Research and Innovation. Diese Forschung wurde durch den BBSRC Core Strategic Program Grant BB/CSP1720/1 und sein konstituierendes Arbeitspaket BBS/E/T/000PR9819 Regulatorische Interaktionen und komplexe Phänotypen sowie durch einen Industriepartnerschaftspreis mit Leaf Expression Systems (BB/P010490/1) finanziert. . SOC dankt außerdem der Max-Planck-Gesellschaft und dem Europäischen Forschungsrat (ERC 788301) für ihre Unterstützung. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Nathaniel H. Sherden

Aktuelle Adresse: Octagon Therapeutics Ltd, 700 Main Street, North Cambridge, MA, 02139, USA

Ingenieurbiologie, Earlham Institute, Norwich Research Park, Norwich, Norfolk, NR4 7UZ, Großbritannien

Quentin M. Dudley, Seohyun Jo und Nicola J. Patron

Abteilung Naturstoffbiosynthese, Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Jena, 07745, Deutschland

Delia Ayled Serna Guerrero, Sarah E. O'Connor und Lorenzo Caputi

John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7TJ, Großbritannien

Monika Chhetry, Mark A. Smedley, Wendy A. Harwood und Nathaniel H. Sherden

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QMD, SEO, LC und NJP haben die Studie konzipiert. QMD führte mit Unterstützung von SJNHS die DNA-Assemblierung und transiente Expression durch und führte Infiltrationsexperimente mit pEAQ-Vektoren durch. QMD führte eine Transkriptomanalyse durch, stellte alle Vektoren für die Mutagenese zusammen, lieferte RNA-Viren für die Mutagenese und führte eine Genotypisierung durch. MC und MAS führten die gesamte Pflanzengewebekultur unter Aufsicht von WAHDASG durch und LC führte die Metabolitenextraktion und -analyse durch. QMD, SEO, LC und NJP haben das Manuskript geschrieben. SEO und NJP erhielten Fördermittel und sorgten für die Aufsicht.

Korrespondenz mit Lorenzo Caputi oder Nicola J. Patron.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Hauptredakteure: Zhijuan Qiu.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dudley, QM, Jo, S., Guerrero, DAS et al. Rekonstitution der Monoterpen-Indol-Alkaloid-Biosynthese in genomtechnisch veränderter Nicotiana benthamiana. Commun Biol 5, 949 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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Eingegangen: 04. Juli 2022

Angenommen: 25. August 2022

Veröffentlicht: 10. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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