Zellbarrieren und Organellen von Pilzen werden durch Polyhexamethylenbiguanid (PHMB) gestört.

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2790 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Ähnlichkeiten zwischen Pilz- und Säugetierzellen stellen inhärente Herausforderungen für die Entwicklung von Behandlungen für Pilzinfektionen dar, da antimykotische Wirkstoffe die Wirtswirtswirkstoffziele durch Arzneimittelüberkreuzung erkennen. Daher steht nur eine begrenzte Anzahl an Medikamentenklassen für die Behandlung zur Verfügung. Die Behandlung wird durch den Erwerb und die Verbreitung von Antimykotika-Resistenzen zusätzlich eingeschränkt, was zum dringenden Bedarf an neuen Therapien beiträgt. Polyhexamethylenbiguanid (PHMB) ist ein kationisches antimikrobielles Polymer mit bakterizider, parasitizider und fungizider Wirkung. Der antimykotische Wirkungsmechanismus scheint eine bevorzugte mechanische Zerstörung mikrobieller Zellstrukturen zu beinhalten und bietet eine Alternative zu herkömmlichen Antimykotika. Die antimykotischen Mechanismen sind jedoch wenig untersucht. Ziel dieser Studie war es, die Aktivitäten von PHMB auf ausgewählte Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans) und filamentöse Pilzarten (Fusarium oxysporum, Penicillium glabrum) zu charakterisieren. Die Zerstörung der Pilzmembran, der Zelleintritt und die intrazellulären Lokalisierungsaktivitäten von PHMB wurden mithilfe von Lebensfähigkeitssondeneintritts- und Polymerlokalisierungsstudien bewertet. Wir beobachteten, dass PHMB zunächst die Zellmembranen von Pilzen permeabilisiert und sich dann im Zytosol anreichert. Sobald es im Zytosol angekommen ist, zerstört es die Kernmembran, was zur DNA-Bindung und -Fragmentierung führt. Die elektrostatische Wechselwirkung von PHMB mit Membranen legt nahe, dass andere intrazelluläre Organellen potenzielle Ziele seiner Wirkung sein könnten. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf mehrere antimykotische Mechanismen hin, die möglicherweise zur Erklärung der Breitbandwirksamkeit beitragen. Ein besseres Verständnis der Wirkmechanismen von PHMB könnte die Entwicklung verbesserter antimykotischer Behandlungsstrategien unterstützen.

Trotz der steigenden Raten invasiver Pilzinfektionen gibt es nur fünf verschiedene chemische Klassen von Antimykotika, die klinisch eingesetzt werden: Azole, Echinocandine, Polyene, Pyrimidinanaloga und Allylamine1. Diese Medikamente sind mit zahlreichen Einschränkungen verbunden, die sie zur Bekämpfung bestimmter neu auftretender Pilzinfektionen ungeeignet machen. Folglich erfüllen sie nicht den klinischen Bedarf, da die Behandlungsergebnisse weiterhin ungünstig sind2. Zu den damit verbundenen Einschränkungen gehören eine schlechte Bioverfügbarkeit, die biochemische Überlappung zwischen Pilzpathogenen und Wirt sowie die Entstehung von Resistenzen3,4. Das Auftreten zunehmender Resistenzen ist zum Teil auf den antimykotischen Mechanismus dieser Klassen zurückzuführen, da jede Klasse in erster Linie ein einzelnes zelluläres Ziel hemmt und fungistatische oder fungizide Folgen hat2. Darüber hinaus zeigen einige Pilzarten eine inhärent verringerte Empfindlichkeit gegenüber einigen Antimykotika, wie z. B. die Resistenz von C. glabrata und C. krusei gegen Fluconazol4. Eine weitere Einschränkung ist die Zugänglichkeit aufgrund des Verabreichungswegs dieser Medikamente. Beispielsweise erreicht die Echinocandin-Klasse aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften wie dem hohen Molekulargewicht eine schlechte orale Bioverfügbarkeit. Um dies zu umgehen, werden sie täglich intravenös verabreicht, was in vielen Situationen als Langzeitbehandlungsoption nicht sinnvoll ist5. Somit decken diese bestehenden Klassen von Antimykotika nicht den ungedeckten klinischen Bedarf bei Pilzinfektionen, insbesondere wenn schwerere invasive Infektionen in Betracht gezogen werden.

Verschiedene kationische antimikrobielle Polymere befinden sich derzeit in der Entwicklung oder werden aufgrund ihrer Fähigkeit, ein breites Spektrum von Mikroorganismen durch elektrostatische Wechselwirkungen ihrer aktiven Gruppen mit der mikrobiellen Oberfläche abzutöten, bereits klinisch eingesetzt6. Beispiele für aktive kationische Gruppen sind Ammoniumgruppen, Halamine, Biguanide oder Polylysin7. Trotz längerer Verwendung dieser Polymere wurde bei Pilzen keine erworbene antimikrobielle Resistenz gegen diese Wirkstoffe beobachtet. Dies könnte auf den unspezifischen Mechanismus gegen Zellbarrieren zurückgeführt werden. Daher könnte der Einsatz antimikrobieller Polymere eine potenziell überlegene Strategie im Wettlauf um wirksame antimykotische Lösungen darstellen. Solche allgemeinen zellschädigenden Eigenschaften werfen jedoch auch toxikologische Bedenken hinsichtlich allgemeiner zytotoxischer Wirkungen auf Wirtszellen auf. Verschiedene kationische Gruppen scheinen unterschiedliche Auswirkungen auf Mikroben- und Wirtszellen zu haben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Guanidin-Polymere wirksamer gegen S. epidermidis, Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA), E. coli und C. albicans sind, während sie im Vergleich zu Amin-Polymeren weniger toxisch für menschliche Keratinozytenzellen sind7.

Polyhexamethylenbiguanid (PHMB) ist ein synthetisches kationisches Polymer, das aus sich wiederholenden Biguanideinheiten besteht und sich als wirksames antimikrobielles Mittel gegen Bakterien und Pilze erwiesen hat9,10. Aufgrund seiner Biguanidgruppen weist es einen hohen therapeutischen Index mit antimikrobieller Breitbandaktivität auf, ohne dass es Berichte über eine erworbene antimikrobielle Resistenz gibt7,11. Das derzeit akzeptierte Modell für die antibakterielle Aktivität von PHMB gegen Bakterienarten basiert auf der Permeabilisierung mikrobieller Membranen, wobei PHMB mikrobielle Zellen selektiv abtötet, indem es durch Wechselwirkung mit Phospholipiden Poren in mikrobiellen Zellmembranen bildet12,13,14. Im Vergleich zu mikrobiellen Zellen zeigte PHMB eine relativ geringere Aktivität mit den Zellmembran-Glykoproteinen auf Zellmembranen von Säugetieren, was den hohen therapeutischen Index des Polymers erklärt14,15. Allerdings kann das Membranzerstörungsmodell die Induktion von DNA-Reparaturwegen in E. coli nach Exposition gegenüber PHMB16 nicht erklären. Ein vorgeschlagener alternativer Wirkmechanismus könnte den energievermittelten Zelleintritt von PHMB in mikrobielle Zellen beinhalten, um intrazelluläre Ziele zu hemmen. Dieser Mechanismus wurde für Bacillus megaterium beobachtet, wo PHMB im Zytoplasma lokalisiert war, ohne dass eine Schädigung der Zellmembran erkennbar war17.

Im Fall von Pilzen ist das Wissen über den Wirkungsmechanismus von PHMB begrenzt, es wurde jedoch ein ähnlicher Mechanismus mit Destabilisierung der Zellwand vorgeschlagen18,19. Es wurde berichtet, dass die β-Glucan-Struktur der S. cerevisiae-Zellwand das Ziel für PHMB-Störungen ist, wobei Genexpressionsstudien auf einen Anstieg der Expression von Zellwandintegritätsgenen (CWI) und Proteinkinase C (PKC) für die Zellerhaltung währenddessen hinwiesen schwierige Umgebungsbedingungen18,19.

In dieser vorliegenden Studie untersuchen wir die antimykotische Wirkungsweise von PHMB gegen ausgewählte Pilzarten Saccharomyces cerevisiae (S288c; ATCC), Fusarium oxysporum, Penicillium glabrum und Candida albicans R1, da sie eine Auswahl häufig vorkommender pathogener Hefen und Fadenpilze darstellen. Wir zeigen, dass PHMB zunächst Pilzzellmembranen permeabilisiert und sich dann im Zytosol ansammelt, wie dies bereits bei Bakterien und Säugetierzellen beobachtet wurde17. PHMB bleibt nicht in Endosomen eingeschlossen, wie es bei Säugetierzellen der Fall ist. Stattdessen entweicht es und zerstört die Kernmembran des Pilzes. Dies führt zur Kondensation der Pilzchromosomen und zum Zelltod. Neben der Kernmembran kann PHMB auch die Membranen anderer Organellen zerstören. Im Gegensatz dazu bleibt PHMB in den Endosomen von Säugetierzellen eingeschlossen, was darauf hindeutet, dass das Polymer zwischen mikrobiellen und nicht-mikrobiellen eukaryotischen Zellstrukturen unterscheidet. Insgesamt tragen die Ergebnisse dazu bei, die antimykotischen Mechanismen von PHMB und seine selektive Toxizität gegenüber eukaryotischen Mikroben zu erklären.

Die Pilzstämme waren Saccharomyces cerevisiae (S288c; ATCC), Fusarium oxysporum, Penicillium glabrum und Candida albicans R1 (S. Kelly; University of Sheffield). Pilze wurden zunächst auf Platten unter Verwendung von Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) 48 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Für Übernachtkulturen wurden einzelne Hefekolonien in Flüssigkultur (RPMI-1640-Medium (Sigma), ergänzt mit 2 % Glucose) überführt. Filamentöse Pilze wurden in 3 ml RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 2 % Glucose, zur Sporensammlung gespült und über Nacht bei 30 °C gezüchtet.

PHMB und mit Rhodamin markiertes PHMB (PHMB-Rhodamin) wurden von Tecrea Ltd, UK, bezogen und Stammlösungen wurden in sterilem dH2O hergestellt. Stammlösungen von Terbinafin (Sigma-Aldrich) wurden in 80 % Ethanol hergestellt. Um einen geeigneten Konzentrationsbereich für die Membranpermeabilisierungstests zu bestimmen, wurden die minimalen Hemmkonzentrationen von PHMB, Negativkontrolle (Terbinafin) und Positivkontrolle (Triton x-114) gegen alle Pilzarten in RPMI-1640, 2 % Glucose, unter Verwendung der Brühe bestimmt Mikroverdünnungsmethode20,21. Eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Reihenverdünnungen des Arzneimittels wurde mit Pilzen (S. cerevisiae, F. oxysporum, P. glabrum und C. albicans R1) in einer Menge von 1 × 104 Zellen/ml beimpft. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert und die Absorption wurde bei OD600 nm gemessen. Die niedrigste PHMB-Konzentration, die das Pilzwachstum zu etwa 90 % hemmte, wurde als MHK90 bzw. etwa 50 % Wachstum als MHK50 bestimmt.

100 µl PHMB, Terbinafin und Triton x-114 wurden in einer Endkonzentration von 1 × 104 Zellen/ml in die Vertiefungen einer 96-Mikrotiterplatte mit Pilzen (S. cerevisiae, F. oxysporum, P. glabrum und C. albicans R1) gegeben MIC50-Konzentration. Als Positivkontrolle der maximalen relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) nach vollständiger Lyse wurden Pilze durch Hitze abgetötet. Pilzkulturen wurden in ein Glasreagenzglas überführt und dann mit einer Bunsenbrennerflamme 10 s lang hitzeabgetötet. Triton x-114 (Sigma Aldrich) wurde als Positivkontrolle des maximalen RFU für eine vollständige Membranpermeabilisierung verwendet. Terbinafin, ein Antimykotikum ohne Membranpermeabilisierungsaktivität, wurde als Negativkontrolle für Zelltod ohne Membranpermeabilisierung verwendet. SYTOX Green (Molecular Probes), ein membrandurchlässiges DNA-Bindemittel, wurde jeder Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 8 µM zugesetzt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Tecan M200 Infinite Pro Microplate Reader mit Magellan-Softwareversion 7.0 bei 485 nm Anregung/520 nm Emission alle 15 Minuten für 3 Stunden bei 30 °C gemessen.

Serielle Verdünnungen von PHMB wurden mit der höchsten Konzentration von 32,4 µg/ml durchgeführt und Pilzzellen (S. cerevisiae, F. oxysporum, P. glabrum und C. albicans R1) in einer Menge von 1 × 104 Zellen/ml in einer 96-Well-Mikroplatte zugesetzt . 8 µM SYTOX Green (Thermofisher) wurden ebenfalls zur Platte gegeben und 3 Stunden lang inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden nach 3 Stunden durchgeführt.

Reihenverdünnungen von PHMB wurden mit der höchsten Konzentration von 4,05 µg/ml durchgeführt, zu S. cerevisiae-Kulturen gegeben (1 × 104 Zellen/ml) und mit 8 µM SYTOX Green (Thermofisher) 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit einem inversen Leica DMIRB-Mikroskop mit Axiovision Rel abgebildet. 4.8-Software (Zeiss) und 40-fach-Objektiv mit Grünband-Passfilter und Phasenkontrast.

Mit Rhodamin markiertes PHMB wurde von Tecrea Ltd, UK (PHMB-Rhodamin) bezogen. Um sicherzustellen, dass die antimykotische Funktion von PHMB nach der Markierung nicht verloren geht, wurde eine Rasenkultur von S. cerevisiae auf SD-Agar hergestellt und mit 10 µl-Tüpfeln von 1 mg/ml PHMB (Tecrea Ltd.) und 1 mg/ml PHMB-Rhodamin 30 inkubiert °C für 48 Stunden.

S. cerevisiae-Kulturen wurden mit PHMB-Rhodamin in einer Konzentration von 4 μg/ml und 8 μg/ml behandelt. Aliquots von C. albicans wurden mit 8 μg/ml und 12 μg/ml behandelt. Die Proben wurden während der Inkubationsschritte vor Licht geschützt. Unbehandelte Kontrollen wurden mit RPMI 1640, 2 % Glucose, behandelt. Die Proben wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und 5 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 50 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS 15 Minuten lang fixiert. Die Proben wurden mit PBS resuspendiert und 5 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in PBS resuspendiert, bevor es mit 50 μg/ml Concanavalin A konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Thermofisher) und 10 μl Prolong Diamond Antifade Mountant mit DAPI (Thermofisher) gegengefärbt wurde. Alle Proben wurden mit Deckgläsern auf Objektträger montiert und mit Nagellack versiegelt. Die Objektträger wurden lichtgeschützt bei 4 °C gelagert. Konfokale Bilder wurden mit einem konfokalen Leica SP5-Mikroskop aufgenommen. Sequentielle Z-Stapel für S. cerevisiae und C. albicans (Schnittzahlen 59 bzw. 35) wurden unter Verwendung eines Liniendurchschnitts von 64 (256 × 256, Zoomfaktor 8) gesammelt. Die Super Resolution Radial Fluctuations (SRRF)-Analyse wurde durchgeführt, indem 1000 Bilder (256 × 256, Zoomfaktor 8) mit einem Liniendurchschnitt von 1 aufgenommen und mit ImageJ Version 1.52i verarbeitet wurden.

S. cerevisiae wurde mit PHMB-Rhodamin in einer Menge von 4 µg/ml und 8 µg/ml behandelt und C. albicans wurde mit 8 µg/ml und 12 µg/ml behandelt. Alle Proben wurden 4 Stunden lang bei 30 °C und vor Licht geschützt inkubiert. Unbehandelte Kontrollen wurden mit den gleichen Volumina RPMI-1640, 2 % Glucose, behandelt. Die Proben wurden wie zuvor für die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben fixiert und gegengefärbt. Die Con A-Alexa Fluor 488-Membranfluoreszenzintensität der entnommenen Zellen (n = 20) wurde an vier symmetrischen Punkten entlang der Zellmembran gemessen. Datenpunkte = (Mittelwert ± SD).

Die Fluoreszenzintensitätsdaten wurden durch wiederholte Messungen (RM), einseitige oder zweiseitige Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest mit der Software GraphPad Prism 7. Signifikanz = p < 0,05.

Um einen geeigneten Konzentrationsbereich für die Membranpermeabilisierungstests zu bestimmen, wurden die minimalen Hemmkonzentrationen von PHMB, der Negativkontrolle (Terbinafin) und der Positivkontrolle (Triton x-114) gegen S. cerevisiae, C. albicans, F. oxysporum und P. bestimmt. Glabrum als repräsentative Art von Hefen und Fadenpilzen. Der PHMB-Rhodamin-MIC90-Wert wurde ebenfalls bestimmt und mit unmarkiertem PHMB verglichen, um zu bestätigen, dass es nach der Markierung zu keinem Verlust der antimykotischen Aktivität kam. Hefezellen scheinen anfälliger für PHMB-Angriffe zu sein als Fadenpilze, da für die Wachstumshemmung eine geringere PHMB-Konzentration erforderlich ist (Tabelle 1). In dieser Studie sind die Terbinafin-MICs für C. albicans R1 und S. cerevisiae etwas niedriger als die gemeldeten Werte22,23. Allerdings stimmen die für F. oxysporum und P. glabrum beobachteten MHK-Werte mit den für die getesteten Pilzarten angegebenen Bereichen überein24,25.

Um den Grad der PHMB-Permeabilisierung von Pilzzellmembranen zu beurteilen, wurde ein Lebensfähigkeitsfärbungstest mit vier Arten (S. cerevisiae, F. oxysporum, P. glabrum und C. albicans R1) durchgeführt. Die Lebensfähigkeitssonde SYTOX Green ist von gesunden Zellen mit intakten Membranen ausgeschlossen, kann jedoch nach Zellmembranschäden in Zellen eindringen. Beim Eintritt in die Zelle bindet SYTOX Green DNA und führt zu einem Anstieg der grünen Fluoreszenzausbeute über die Grundfluoreszenz hinaus. Das Antimykotikum Terbinafin wurde als Negativkontrolle verwendet, um die antimykotische Wirksamkeit ohne Membranstörung zu zeigen. Als Positivkontrollen wurden die Zellen durch Hitze abgetötet oder mit Triton X-114 behandelt. Die einzige Kultur-Negativkontrolle zeigte die Grundfluoreszenz von SYTOX Green. Bei allen Pilzarten blieb die reine Kulturkontrolle über die Zeit konstant bei etwa 4000–5000 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) (Abb. 1). Für die Terbinafin-Negativkontrolle wurde bei jeder Pilzart nur ein leichter Anstieg der Fluoreszenz über der Grundfluoreszenz beobachtet. Die durch Hitze abgetötete Positivkontrolle zeigte zum Zeitpunkt 0 für jede Spezies einen erheblichen Anstieg der Fluoreszenz, der über die Zeit relativ konstant blieb. Die positive Fluoreszenzkontrolle von Triton Zunahme der Fluoreszenz.

Der Einfluss der Zeit auf die PHMB-assoziierte Membranpermeabilisierung. Pilze wurden mit PHMB [MIC50] und SYTOX Green (8 µM) behandelt. Es werden Fluoreszenzprofile für jede mit PHMB behandelte Spezies angezeigt, mit positiven (durch Hitze abgetöteten; Triton x-114) und negativen (Terbinafin; unbehandelten) Kontrollen. (A) S. cerevisiae durch Hitze abgetötet oder mit 1 µg/ml PHMB, 0,84 µg/ml Terbinafin, 1,17 µg/ml Triton x-114 behandelt. (B) C. albicans R1 durch Hitze abgetötet oder mit 1 µg/ml PHMB behandelt , 0,84 µg/ml Terbinafin, 1,17 µg/ml Triton x-114 (C) F. oxysporum hitzegetötet oder behandelt mit 2 µg/ml PHMB, 3,84 µg/ml Terbinafin, 4,7 µg/ml Triton x-114 (D) P. glabrum durch Hitze abgetötet oder mit 2 µg/ml PHMB, 1,7 µg/ml Terbinafin, 2,5 µg/ml Triton x-114 behandelt.

In ähnlicher Weise zeigten mit PHMB MIC50 behandelte S. cerevisiae und C. albicans nach 15 Minuten einen erheblichen Anstieg der Fluoreszenz, was auf eine Membranpermeabilisierung hinweist. Bei den Fadenpilzen zeigte F. oxysporum jedoch einen leichten Anstieg der Fluoreszenz und P. glabrum zeigte nach der PHMB-Behandlung keinen Anstieg der Fluoreszenz, was auf eine minimale bis keine Zellpermeabilisierung hindeutet.

Um die Permeabilisierung der PHMB-Membran und die anschließende grüne Fluoreszenz von SYTOX sichtbar zu machen, wurden lebende S. cerevisiae-Zellen 3 Stunden lang mit PHMB behandelt und dann mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Unbehandelte Zellen zeigten keine erkennbare Fluoreszenz. Durch Hitze abgetötete positive Kontrollproben zeigten in den meisten Zellen eine starke zellassoziierte grüne SYTOX-Fluoreszenz. Die Permeabilisierung der Zellmembran/grüne SYTOX-Fluoreszenz nahm mit steigenden PHMB-Konzentrationen (von 0,51 bis 2,03 µg/ml) zu, was den MHK-Werten weitgehend entspricht (Abb. 2). Bei PHMB-Konzentrationen über der MHK90 verringerten sich der Anteil der Zellen, die Fluoreszenz zeigten, und die Stärke der Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass PHMB mit der DNA in den Zellen interagiert und die anschließende Bindung durch SYTOX-Grün blockiert.

Fluoreszenzbildgebung, die die Wirkung von PHMB auf die Membranpermeabilität für SYTOX Green zeigt. SYTOX Green (8 µM) und verschiedene PHMB-Konzentrationen wurden dem Wachstumsmedium vor der 3-stündigen Inkubation mit S. cerevisiae zugesetzt. Live-Zellbilder wurden nach der Bildgebung mittels Phasenkontrast und grünem Bandpassfilter zusammengeführt. Maßstabsbalken = 10 µm.

Um den Einfluss der PHMB-Exposition auf die Integrität der Pilzzellmembran zu bestimmen, wurden S. cerevisiae und C. albicans mit PHMB-Rhodamin in ihren jeweiligen MIC90-Konzentrationen und höher behandelt und dann mit Con A-Alexa Fluor 488 gegengefärbt. S. cerevisiae (MIC90 = 4 µg/ml, über MHK90 = 8 µg/ml) und C. albicans (MHK90 = 8 µg/ml, über MHK90 = 12 µg/ml). Die Membranfluoreszenz wurde durch Messung von vier symmetrischen Punkten entlang der Zellmembranen zufällig ausgewählter Zellen (n = 20) mit ImageJ quantifiziert (Abb. 3). Die Fluoreszenzintensität von membrangefärbtem Con A-Alexa Fluor 488 nahm mit steigenden PHMB-Konzentrationen bei beiden Spezies ab.

Fluoreszenzbildgebung, die die Verringerung der Con A-Membranfluoreszenz nach Exposition gegenüber steigenden PHMB-Konzentrationen zeigt. (A) S. cerevisiae-Kulturen wurden mit PHMB-Rhodamin bei 4 µg/ml und 8 µg/ml behandelt. (B) C. albicans-Kulturen wurden mit 8 µg/ml und 12 µg/ml behandelt. Die Kulturen wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit Con A-Alexa Fluor 488 gegengefärbt. Unbehandelte Kontrolle = nur Wachstumsmedium. Die Bilder zeigen die Abschwächung der Membranfluoreszenzintensität mit zunehmender PHMB-Konzentration. Die Diagramme zeigen die gemessene Fluoreszenzintensität der beprobten Zellen (n = 20) an vier symmetrischen Punkten entlang der Zellmembran und gemittelt (Mittelwert ± SD). Die Membranfluoreszenz wurde mittels RM One-way ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest.

Um die Auswirkungen der PHMB-Konzentration auf das Ausmaß der Zellmembranpermeabilisierung zu bestimmen, wurde ein Bereich von PHMB-Konzentrationen bis zu 32 µg/ml gegen ihre Fluoreszenzwerte nach 3 Stunden aufgetragen (Abb. 4). Die Fluoreszenz blieb bei allen Pilzarten bei unter MIC50 im Hintergrund. Es gab jedoch einen konzentrationsabhängigen Anstieg der Fluoreszenz, der bei 0,25 µg/ml für S. cerevisiae, 0,38 µg/ml für C. albicans und 1,01 µg/ml für F. oxysporum begann, wobei maximale Fluoreszenzspitzen bei oder in der Nähe der PHMB MIC50-Konzentrationen auftraten für S. cerevisiae (12.143 RFU, 1,01 µg/ml), C. albicans (7091 RFU, 1,01 µg/ml) und F. oxysporum (2.503 RFU, 3 µg/ml) aufgrund einer erhöhten Zellmembranpermeabilität. Bei PHMB-Konzentrationen über MIC90 kommt es zu einem Verlust der grünen Fluoreszenz von SYTOX. Da PHMB die Fähigkeit besitzt, DNA16 zu binden, übertrifft es wahrscheinlich die grüne Bindung von SYTOX, um das Fluoreszenzsignal zu löschen. Da die Permeabilisierung von PHMB offenbar sowohl von der Konzentration als auch von der Zeit abhängt, wurde die Rate der PHMB-Aufnahme aus den gesammelten Daten berechnet. P. glabrum wurde ausgeschlossen, da zuvor kein Anstieg der Zellmembranpermeabilität/SYTOX-Grünfluoreszenz beobachtet wurde.

Die Wirkung der PHMB-Konzentration auf die Permeabilisierung der Pilzzellmembran. SYTOX Green (8 µM) und PHMB-Konzentrationen wurden Pilzen (1 × 104 Zellen/ml) in RPMI-1640, 2 % Glucose, zugesetzt. Die Proben wurden 3 Stunden lang inkubiert, wobei nach der Inkubationszeit Fluoreszenzmessungen durchgeführt wurden. (A) P. glabrum (B) F. oxysporum (C) C. albicans (D) S. cerevisiae. Gelber Pfeil = MIC50-Konzentration. Blauer Pfeil = MIC90-Konzentration.

Um die Rate der PHMB-Aufnahme in Pilze zu bestimmen, wurden die PHMB-Konzentrationen gegen die jeweilige Zeit aufgetragen, die für die maximale Permeabilisierung der Zellmembran benötigt wurde. wobei die maximale Permeabilisierung der Zellmembran die maximale Fluoreszenz (RFU) ist, die aufgrund der SYTOX Green: DNA-Bindung erzeugt wird (Abb. 5). Die Aufnahmerate bei 300 °C wurde für F. oxysporum, S. cerevisiae und C. albicans mit 0,03775 μg/ml min-1, 0,03177 μg/ml min-1 und 0,04607 μg/ml min-1 berechnet (Tabelle 2). Bei PHMB-Konzentrationen von 8 μg/ml und mehr tritt die Permeabilisierung der Pilzzellmembran sofort auf, wobei die maximalen RFU-Werte zum Zeitpunkt 0 für alle Arten erreicht werden. Für F. oxysporum wird die maximale Permeabilisierung bei ~ 180 Minuten bei MHK90 und 180 < Minuten bei MHK50-Konzentrationen erreicht.

PHMB-Aufnahmerate durch F. oxysporum, S. cerevisiae und C. albicans. Die Aufnahme wurde mit 0,04 µg/ml min−1, 0,03 µg/ml min−1 bzw. 0,05 µg/ml min−1 bei Konzentrationen von 8 µg/ml und mehr berechnet. (A) F. oxysporum, (B) C. albicans, (C) S. cerevisiae. Rote Linie = MIC90-Konzentration, gelbe Linie = MIC50-Konzentration, blaue Linie = lineare Regression.

An fixierten Hefezellen wurde eine konfokale Bildanalyse durchgeführt, um die intrazelluläre Lokalisierung zu bestätigen. Durch Z-Stack-Bildgebung aufgenommene Querschnitte der Hefezellen bestätigen die intrazelluläre Akkumulation von PHMB sowohl in S. cerevisiae als auch in C. albicans (Abb. 6, 7). Diagrammanalysen zeigen bei beiden Arten auch das Vorhandensein von PHMB auf der Zellmembran in geringeren Konzentrationen im Vergleich zum Zytoplasma. Die Kernlokalisation von PHMB in C. albicans und S. cerevisiae war in der Mehrzahl der Zellen erkennbar. Darüber hinaus war die DAPI-Färbung im Vergleich zu anderen Zellfärbungen schwächer, was möglicherweise auf eine Kernstörung zurückzuführen ist, da nicht alle Kerne intakt waren. Daher scheint PHMB in Zellen einzudringen und sich im Zytoplasma und Zellkern zu lokalisieren.

Konfokale Bildgebung von mit PHMB inkubierten S. cerevisiae. S. cerevisiae wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur mit PHMB-Rhodamin (4 µg/ml) behandelt. Die Zellen wurden mit DAPI und Con A-Alexa Fluor 488 gegengefärbt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Obere Felder: Konfokale Bilder vor (links) und nach (rechts) der Bildverarbeitung durch SRRF. Unten links: Querschnittsansicht konfokaler Z-Stapel von S. cerevisiae (59 Scheiben). Die Bilder zeigen die Akkumulation von PHMB-Rhodamin im Zytosol und die Co-Lokalisierung mit dem Zellkern (DAPI). Die Grafik bestätigt eine hohe intrazelluläre Akkumulation von PHMB-Rhodamin.

Konfokale Bildgebung von mit PHMB inkubierten C. albicans. C. albicans wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur mit PHMB-Rhodamin (4 µg/ml) behandelt. Die Zellen wurden mit DAPI und Con A-Alexa Fluor 488 gegengefärbt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Obere Felder: Konfokale Bilder vor (links) und nach (rechts) der Bildverarbeitung durch SRRF. Unten links: Querschnittsansicht konfokaler Z-Stapel von C. albicans (35 Scheiben). Die Bilder zeigen die Akkumulation von PHMB-Rhodamin im Zytosol und die Co-Lokalisierung mit dem Zellkern (DAPI). Die Grafik bestätigt eine hohe intrazelluläre Akkumulation von PHMB-Rhodamin.

Polyhexamethylenbiguanid ist ein kationisches Polymer mit antimikrobiellen Breitbandaktivitäten. Frühere Studien zur Aufklärung der antimikrobiellen Mechanismen von PHMB konzentrierten sich auf seinen antibakteriellen Mechanismus13,14,17. Ursprünglich wurde angenommen, dass der antibakterielle Mechanismus durch die Zerstörung der Zellmembran vermittelt wird13,14. Nach derzeitigem Kenntnisstand gelangt PHMB jedoch in die Bakterienzellen, wo sich das Polymer anschließend an die Bakterienchromosomen bindet und diese kondensiert, was zum Stillstand der Zellteilung und zum Tod führt17. Daher haben wir in dieser Studie versucht, den antimykotischen Mechanismus des Polymers aufzuklären.

Zunächst wurden die MHKs von PHMB, PHMB-Rhodamin, Positivkontrolle Triton x-114 und Negativkontrolle Terbinafin ermittelt, um geeignete Konzentrationen von Arzneimitteln zu bestimmen, die für alle Membranpermeabilisierungs- und Bildgebungstests verwendet werden sollen. Der SYTOX-Green-Assay wurde verwendet, um die Bedeutung der Zellmembranpermeabilisierung als ersten Schritt bei vier Pilzarten (S. cerevisiae, C. albicans, F. oxysporum, P. glabrum) zu bestimmen (Abb. 1). SYTOX grün ist ein kationischer Farbstoff, der von gesunden Zellen ausgeschlossen ist, aber bei Membranpermeabilisierung durch andere Wirkstoffe in die Zelle eindringen kann, wo er an DNA bindet und ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Die beobachtete Permeabilisierung der Zellmembran schien sowohl von der Expositionszeit als auch von der PHMB-Konzentration abzuhängen. Insbesondere die Hefearten (S. cerevisiae und C. albicans) zeigten im Vergleich zu den Fadenpilzen (F. oxysporum, P. glabrum) nach 15 Minuten einen erheblichen Anstieg der PHMB-Zellpermeabilisierung und der anschließenden Fluoreszenz nach PHMB-Behandlung bei MIC50 (Abb . 1). Die Fluoreszenzintensität schien auch bei PHMB-Konzentrationen in der Nähe ihrer jeweiligen MIC50-Werte für alle Pilzarten ihren Höhepunkt zu erreichen, gefolgt von einem Verlust des Fluoreszenzsignals (Abb. 2, 4). Dieser plötzliche Fluoreszenzverlust nahe und über MIC90 wurde bereits zuvor auch bei Bakterien beobachtet17. Dies deutet darauf hin, dass die Membranpermeabilisierung nicht der einzige Wirkungsmechanismus des Polymers ist, da eine Erhöhung der Membranpermeabilisierung zu einer Erhöhung der SYTOX Green:DNA-Fluoreszenz führen sollte. Der Fluoreszenzverlust ist wahrscheinlich auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen, da PHMB wie SYTOX grün die Fähigkeit besitzt, an DNA16 zu binden. Bei höheren Konzentrationen dringt PHMB in den Zellkern des Pilzes ein und bindet sich an die DNA, wodurch die Bindung von SYTOX-Grün verhindert und das gemessene Fluoreszenzsignal gelöscht wird.

Wie bereits erwähnt, führten die filamentösen Pilzarten F. oxysporum und P. glabrum nach der PHMB-Behandlung bei ihrem MIC50-Wert zu keinem signifikanten Anstieg des Fluoreszenzsignals (Abb. 1). Diese Beobachtung wurde auch für mit dem Detergenz Triton In Übereinstimmung mit dem PHMB-MIC von Tabelle 1 scheinen daher die Anfälligkeit von Pilzen sowie der anfängliche Permeabilisierungsmechanismus durch die Zugänglichkeit von PHMB zur Pilzzelloberfläche beeinflusst zu werden. Hefe- und Fadenpilze weisen überlappende, aber auch deutliche Unterschiede in ihren Zelloberflächenstrukturen auf.

Im Allgemeinen bestehen Pilzzellwände aus zwei Schichten: einer evolutionär konservierten Innenschicht und einer heterogenen Außenschicht. Die innere unlösliche Schicht besteht aus Kohlenhydraten, darunter Chitin, β-(1,3)-Glucan und β-(1,4)-Glucan, die für die Festigkeit der Zellwände von Pilzen erforderlich sind27. Während die äußere Schicht hauptsächlich aus glykosylierten Proteinen, einschließlich Mannose-Proteinen, besteht, die kovalent an die β-(1,3)-Glucan-Chitin-Matrix gebunden und auch phosphoryliert sind28. Die Phosphorylierung der Chitinmatrix verleiht der Pilzoberfläche eine anionische Ladung, die elektrostatische Wechselwirkungen mit kationischem PHMB zur Destabilisierung der Zellwand und anschließenden Permeabilisierung der Zellmembran ermöglichen würde. Dies ist in den Abbildungen dargestellt. 2, 3, wobei PHMB im Laufe der Zeit die Zellmembranen von Hefepilzen permeabilisiert.

Im Gegensatz dazu enthalten einige Fadenpilze auch α-(1,3)-Glucan in der äußeren Schicht der Zellwand, das in den Zellwänden von S. cerevisiae, C. albicans und verschiedenen anderen Hefen fehlt27,28. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von α-(1,3)-Glucan in den Zellwänden filamentöser Pilze die Aggregation keimender Konidien in Aspergillus spp. induziert. und Penicillium spp.29. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein einer extrazellulären Matrix einen „Biofilm-ähnlichen“ Schutz verleihen, der die Fähigkeit von PHMB, auf die Zellmembran zuzugreifen und seine antimykotische Wirkung auszuüben, verzögern könnte30.

Da die Aufnahme von PHMB in Pilze durch die Einwirkzeit und -konzentration beeinflusst wurde, wurde für S. cerevisiae, C. albicans und F. oxysporum die Aufnahmerate des Polymers sowie die Einwirkzeit, die für eine vollständige Permeabilisierung bei 30 °C erforderlich ist, bestimmt (Abb. 5, Tabelle 2). Die Aufnahmerate bei 30 °C wurde für F. oxysporum, S. cerevisiae und C. albicans mit 0,03775 μg/ml min-1, 0,03177 μg/ml min-1 und 0,04607 μg/ml min-1 berechnet (Tabelle 2). ). Die Permeabilisierung der Zellmembran beginnt bei PHMB-Konzentrationen über MIC90 für alle Pilzarten schnell zum Zeitpunkt 0. Die für die maximale Permeabilisierung bei PHMB MIC50 erforderliche Zeit war für F. oxysporum im Vergleich zur Hefespezies deutlich länger. Wie bereits erwähnt, ist dies wahrscheinlich auf die Polymerbindung an die extrazelluläre Matrix filamentöser Pilzarten zurückzuführen, wodurch die lokale Konzentration von PHMB an der Pilzmembran wirksam verringert wird.

Um die intrazelluläre Anreicherung von PHMB zu bestätigen, wurde eine konfokale Bildanalyse an fixierten S. cerevisiae und C. albicans durchgeführt. Durch Z-Stack-Bildgebung aufgenommene Querschnitte der Hefezellen bestätigten die intrazelluläre Akkumulation von PHMB sowohl in S. cerevisiae als auch in C. albicans (Abb. 6, 7). Der Zellkern schien auch fragmentiert zu sein, was mit einer Verringerung der DAPI-Färbung einherging. Die Bindungsaffinität von PHMB an DNA zur Chromosomenkondensation wurde bereits zuvor bei Prokaryoten beobachtet, bei denen DNA im Zytoplasma besser zugänglich ist7,17. Im Gegensatz dazu in eukaryotischen Säugetierzellen; PHMB wird von der Kernhülle ferngehalten, in Endosomen gespeichert und entsorgt7. Trotz der gemeinsamen eukaryotischen Klassifizierung von Säugetier- und Pilzzellen unterscheidet das Polymer mechanistisch zwischen mikrobiellen und nicht-mikrobiellen eukaryotischen Zellen, um den Zelleintritt zu erleichtern. Diese Unterscheidung kann auf Unterschiede in der Membranlipidzusammensetzung von Pilzen und Säugetieren zurückzuführen sein. Die Sequestrierung von PHMB in Endosomen von Säugetierzellen und dessen anschließende Entfernung erklärt, warum zwischen den antimykotischen Wirkungen in vitro und den allgemeinen zytotoxischen Wirkungen ein großes therapeutisches Fenster besteht.

Es ist allgemein anerkannt, dass frühe Endosomen die gleiche Lipidzusammensetzung wie ihre Zellmembranen aufweisen. Endosomale Membranen von Säugetieren bestehen aus Phosphatidylcholin (> 50 %, keine Nettoladung), Phosphatidylethanolamin (keine Nettoladung), Phosphatidylserin (−ve-Ladung), Phosphatidylinositol (−ve-Ladung) und Phosphatidsäure (−ve-Ladung)31. Obwohl die endosomalen Membranen von Pilzen ebenfalls aus diesen Phospholipiden bestehen, kommen sie in unterschiedlichen Anteilen vor. Beispielsweise enthalten die Zellmembranen von S. cerevisiae mehr Phosphatidylserin (~ 30 %) und Phosphatidylinositol (~ 27 %) und besitzen daher eine stärkere negative Nettomembranladung32. Dies legt nahe, dass die antimikrobielle Wirkung von PHMB möglicherweise auf der Stärke der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem kationischen Polymer und den anionischen Phospholipiden beruht.

Darüber hinaus zeigten Plotanalysen (Abb. 6, 7) bei beiden Arten auch das Vorhandensein von PHMB auf der Zellmembran in geringeren Konzentrationen im Vergleich zum Zytoplasma. Die geringe Membranakkumulation von PHMB untermauert die Behauptung, dass die Permeabilisierung der Zellmembran nicht der einzige antimykotische Mechanismus ist. Im Allgemeinen wird bei membranpermeabilisierenden Wirkstoffen wie Amphotericin B und anderen membranpermeabilisierenden Arzneimitteln eine Membranakkumulation beobachtet, die hier nicht beobachtet wurde33.

Folglich scheint PHMB über die Membranpermeabilisierung ungehindert in Pilzzellen einzudringen, ohne in Endosomen eingeschlossen zu werden (Abb. 8). Beim Eintritt in die Zelle reichert es sich im Zytoplasma an, wo es anschließend den Zellkern zerstört und an die DNA bindet. Die beobachtete Kernzerstörung lässt darauf schließen, dass es weitere potenzielle intrazelluläre Ziele von PHMB gibt, da die Kernmembran und die Membran des endoplasmatischen Retikulums zusammenhängend sind. Darüber hinaus sind Hefe-Mitochondrien ebenso wie Bakterien prokaryotischen Ursprungs. Daher bedarf die mögliche Wechselwirkung von PHMB mit anderen Organellen weiterer Untersuchungen.

Schematische Darstellung der unterschiedlichen Anfälligkeit von Hefen und Fadenpilzen gegenüber PHMB. (A) Hefezellen sind anfälliger für PHMB-Angriffe, da die Zellwand anionisch ist, was die Adhäsion des Polymers ermöglicht. Darüber hinaus werden während der Knospung die β-(1,3)-Glucan- und Chitinmatrix freigelegt, was den Eintritt in PHMB-Zellen erleichtern könnte. (B) Filamentöse Pilze scheinen aufgrund des Vorhandenseins der extrazellulären Matrix (ECM) weniger anfällig für PHMB-Angriffe zu sein. Das ECM verleiht PHMB einen biofilmähnlichen Schutz, indem es das Polymer effektiv bindet. Verringerung seiner lokalen Konzentration an der Zellmembran des Pilzes. PHMB-Penetration und Zugänglichkeit von Hyphen/Konidiophoren. Während der Konidienkeimung wird jedoch α-1,3 in den Zellwänden freigelegt, was die negative Ladung der Konidien erhöht und somit die antioxidative Aktivität des kationischen PHMB erhöht.

PHMB erhält Zugang zur Pilzzellmembran, wo es durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Zellmembran interagiert und den Permeabilisierungsprozess in Gang setzt. Nach Zerstörung der Zellmembran reichert es sich im Zytosol an, wo es die Kernmembran zerstört und sich zur weiteren Fragmentierung an die DNA bindet. Obwohl vier Pilzarten analysiert wurden, gehören sie zu zwei großen Pilzfamilien, nämlich Saccharomycetaceae und Nectriaceae. Daher spiegeln ihre beobachteten Wechselwirkungen mit PHMB eine viel größere Pilzgattung wider. Diese Studie liefert ein besseres Verständnis des unspezifischen Wirkmechanismus von PHMB als alternatives Antimykotikum mit geringem Resistenzrisiko. Das Ausmaß der Anfälligkeit der Pilzzellwände und der Interaktion mit anderen Organellen muss jedoch noch beurteilt werden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Andrew Hibbert (RVC) für seine Unterstützung bei der Konfokal- und Fluoreszenzbildgebung und Dr. David Cook (Blueberry Therapeutics Ltd.) für seine Unterstützung bei der Durchsicht des Manuskripts und der Bereitstellung kritischen Feedbacks.

Diese Arbeit wurde vom BBSRC, dem Londoner interdisziplinären Doktorandenausbildungsprogramm (LIDo) (Projektreferenz: 1906777, Fördernummer BB/M009513/1) und Blueberry therapeutisches Ltd. finanziert. Darüber hinaus sind alle Autoren derzeit Mitarbeiter von Tecrea Ltd, einem Spin-Unternehmen eines Biotechnologieunternehmens vom Royal Veterinary College, das die Nanoabgabe mithilfe von PHMB ermöglicht.

Pathobiologie und Populationswissenschaften, The Royal Veterinary College, London, England

Winnie North-Boaz, Isabelle Papandronicou, Josephus Miculob und Liam Good

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WNB leitete die Datenanalyse, überwachte die Datenerhebung und verfasste das Manuskript. WNB und IP führten Tests zur minimalen Hemmkonzentration durch. IP führte den SYTOX-Grün-Permeabilisierungstest und die Fluoreszenzbildgebung von PHMB mit Pilzen durch. JM führte eine konfokale Bildgebung der PHMB-Anreicherung in Pilzen durch. LG entwarf das Konzept dieser Arbeit, überwachte die Datenerhebung und überarbeitete das Manuskript.

Korrespondenz mit Winnie Tax Officer.

Alle Autoren sind derzeit Mitarbeiter von Tecrea Ltd, einem Biotechnologieunternehmen, das aus dem Royal Veterinary College hervorgegangen ist und die Nanoabgabe mittels PHMB ermöglicht.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ntow-Boahene, W., Papandronicou, I., Miculob, J. et al. Die Zellbarrieren und Organellen von Pilzen werden durch Polyhexamethylenbiguanid (PHMB) gestört. Sci Rep 13, 2790 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29756-w

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Eingegangen: 12. September 2022

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29756-w

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